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Janvier 2002 - Examen corrige

L'examen de la séquence du génome humain montre que les revendications de ... de masse TOF (Time of Flight) sous ses différents aspects et la RMN. ...... d' autres pesticides comme diazinon et chlorpyrifos, mais surtout sur sarin et soman .




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irréductibles.
Les deux techniques comportent une phase shotgun sur des segments génomiques au hasard, puis un réassemblage utilisant les recouvrements en évitant de tomber dans le piège des séquences répétées. On effectue ensuite de nouveaux séquençages, quand il y a un doute, et pour boucher les trous. Des séquençages shotgun à 6-8 reprises d'un même segment sont usuellement utilisés pour limiter la phase de raffinement qui coûte cher.
Dans l'entreprise publique internationale de séquençage "clone par clone", ce sont des blocs d'à peu près 150 000 pb qui ont été, au préalable, clonés dans des chromosomes bactériens artificiels et séquencés, chacun, par la méthode shotgun (shotgun hiérarchique). La méthode à l'avantage de minimiser les erreurs d'assemblage, car on sait d'où les séquences, de l'ordre de 600 à 800 pb, viennent. Le coût de la phase cartographie des clones est de 10% du total, celui du shotgun consécutif est de 50-60% (pour une couverture de 5-6 fois) et celui de la finition est de 30-40%.
Celera a choisi la voix d'un shotgun généralisé, sans clonage préalable de grands fragments, suivi d'un réassemblage global informatisé. Cette technique n'est pas nouvelle dans la mesure, où c'est celle qui a été utilisée pour les protéines depuis 50 ans.
Cela a relativement bien marché pour la drosophile, mais avec environ 2 500 trous. L'examen de la séquence du génome humain montre que les revendications de Celera sont très surfaites. En effet, la séquence "publique" a été découpée et utilisée pour rétablir l'ordre des innombrables fragments obtenus par shotgun, ce que l'informatique n'avait, apparemment, pas réussi à faire. La séquence des BACs a été, par ailleurs, utilisée pour combler les lacunes des séquences de la méthode shotgun, etc…
La concordance des deux séquences, utilisée par Celera pour vanter sa prouesse n'est donc que très normale, et ne prouverait rien, puisque la séquence de Celera a utilisé directement celle du projet public. On ne sait donc pas ce que la technique peut valoir à cette échelle.
Il reste que, même dans ces conditions, 20% de la séquence manque ou est présente sous forme de 116 000 microséquences (de 2,3 kb en moyenne) non placées. Il semble bien que la rapidité du séquençage est plus liée à la multiplicité des machines capillaires crachant 500 à 1000 séquences, chacune, par jour, qu'à la technique shotgun par elle-même. Ce qui le montre, c'est que dès que le consortium public a pu disposer du même nombre de séquenceurs capillaires, sa cadence a atteint et même dépassé celle de Celera avec la technique clone par clone.
Dans le cas de la drosophile, au génome plus compact, Celera a dû séquencer une quinzaine de fois le génome pour pallier les lacunes du shotgun global, ce qui a doublé les frais du shotgun considéré comme plus économique. De toute façon il a fallu recourir aux séquences à partir de clones pour raffiner la séquence.
L'auteur affirme, enfin, qu'au lieu d'inciter à un travail plus efficace, cette course a été néfaste, car elle a encouragé des raccourcis risqués. La compétition a eu également des effets pervers dans l'entreprise "publique". En effet, l'analyse des BACS a été parfois bâclée pour gagner du temps. Par ailleurs, il ne paraît pas évident que la décision de publier une ébauche de séquence de qualité intermédiaire ait été judicieuse (voir les séquences des riz dans "Les Productions Végétales"). L'ardeur des séquenceurs s'est émoussée à partir de là, et la finition risque d'être plus longue que prévue (on le saura dès l'an prochain, date fixée antérieurement).L'auteur ne met pas en cause la compétition, mais souligne que le financement privé de Celera a faussé le jeu en suscitant des désinformations et des surenchères injustifiées. Pour Waterston et al., l'analyse des données publiées par Celera n'exclut pas la possibilité de séquencer par shotgun global de gros génomes comme ceux de mammifères, mais ne le démontre nullement.
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3. Le numéro de Février de Current Opinion in Biotechnology est traditionnellement consacré aux techniques, ici d'exploitation de l'ébauche du génome humain et plus généralement des différentes "X–omiques".
B Schweitzer et al.; p.14–19 commentent les avancées récentes dans le domaine des réseaux de protéines, en soulignant ce qui reste encore à améliorer sérieusement avant d'en tirer tous les bénéfices. TJ Phelps et al.; p.20-24, se concentrent sur l'utilisation des microréseaux pour l'analyse des modifications métaboliques et phénotypiques entraînées par des fluctuations du milieu.
Ce sont surtout les mutations intervenant dans des voies métaboliques connues dont les effets sont analysés. Le suivi des métabolites est obtenu par des technologies à réponse rapide comme la spectrométrie de masse TOF (Time of Flight) sous ses différents aspects et la RMN. On obtient ainsi des carte des fluxs métaboliques. Les facteurs du milieu qui ont été utilisés sont la fluctuation des donneurs d'électrons, des agents stressants et, notamment, de la température.
L'utilisation du 13C des lipides microbiens pour l'étude du métabolisme géochimique est analysée par CL Zhang p.25-30. La composition d'un consortium anaérobie d'archées associées à des bactéries réduisant le soufre a ainsi pu être analysé. Une telle étude est intéressante pour le devenir des hydrates de méthane
Parmi les capteurs et interrupteurs biologiques, le cas de ribozymes allostériques qui permettent d'obtenir des basculeurs ne fonctionnant qu'en présence d'une molécule spécifique allant d'oligonucléotides à des protéines, est traité par RR Breaker; p.31–39. D'autres ligands sont possibles.
WCW Chan et al.; p.40–46, analysent les nouvelles techniques permettant la production des "quantum dots". Elles utilisent des nanocristaux de métaux ou de semi conducteurs de 2 à 6 nm qui ont la particularité d'avoir des propriétés physiques dépendant de leur taille et d'être, par ailleurs, d'une taille voisine des macromolécules biologiques (voir le §100). Les recherches récentes de plusieurs groupes ont portés sur de telles particules liées à diverses macromolécules (peptides, protéines ou ADN). Ceci permet d'inventer des mesures en milieu homogène, ou de créer des marqueurs fluorescents multicolores jouant sur la taille des particules pour la couleur, par exemple, et permettant des analyses multiplex. Je n'ai pas tout compris, mais cela me semble passionnant. .
DP Allison et al.; p.47-51 décrivent les applications du microscope à force atomique qui permet de mesurer des couples de l'ordre du piconewton, qui correspondent aux forces maintenant les structures des macromolécules. On utilise un microcantilever en nitrure de silicium pour mesurer les forces présentes. L'utilisation des anticorps permet d'ajouter une dimension à ce type d'études. On trouvera également, dans ce numéro, des mises au point sur l'amplification de génomes complets, l'identification des protéines parmi leurs isomères, et l'utilisation de diverses techniques informatiques pour l'analyse des masses de données qui nous submergent.
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4. L'ARN polymérase II (RNAP II) ne peut assurer la transcription qu'associée à de nombreux co-facteurs, et à laquelle le complexe Mediator transmet les éléments nécessaires à la régulation. On distingue les facteurs généraux de transcription (GTFs) qui sont exigés pour une initiation précise de la transcription par RNAP II.
La stimulation de la transcription en réponse à des activateurs spécifiques d'un promoteur donné fait intervenir divers co-facteurs. Mediator en fait partie. Découvert il y a deux ans, c'est le plus universel. Les sous-unités de ce complexe interagissent individuellement et directement avec plusieurs protéines régulatrices.
Une revue sur l'architecture ce complexe fondamental est parue dans NA Woychik et al.; Cell 108 (22FEB02) 453–463.
RNAP II comporte 12 sous-unités très fortement conservées, de la levure aux mammifères. Son architecture est maintenant connue à l'échelle atomique, ce qui permet d'envisager une analyse fine de son fonctionnement.
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5. La recombinase Cre du bactériophage P1 a largement été utilisée pour des clivages sites spécifiques d'acides nucléiques. Biologiquement, son rôle est de cliver des dimères génomiques en monomères. Elle reconnaît, en effet, un motif spécifique de 34 pb, loxP constitué d'un palindrome sauf pour les 8 pb internes. On gagnerait à pouvoir modifier cette spécificité pour ne pas avoir à introduire les séquences loxP aux sites de clivage souhaités. Un article sur le sujet vient de paraître avec S Santoro et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (02APR02) 4185-4190. Il complète le §42 du Bulletin d'Avril, et analyse la spécificité de séquences de plusieurs variants engendrés par évolution dirigée.
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6. On trouvera dans AE Pasquinelli; Trends in Genetics 18 (APR02) 171-173, une revue sur les microARNs intervenant dans l'univers des interférences ARNs diverses. Ce sont ces petits ARNs d'une vingtaine de nucléotides issus d'ARNs doubles-brins envoyant à l'abattoir les messagers qui contiennent des séquences homologues. Ils peuvent avoir un rôle de défense contre les virus, de régulation au cours du développement, et embêter les technologues surexprimant des transgènes.
Plus amusant est le fait qu'on a utilisé ce mécanisme de "silencing" pour identifier, chez Caenorhabditis elegans, les gènes intervenant dans son déroulement. On a ainsi montré que les gènes mes-3, -4 et –6 codant des protéines associées à la chromatine sont impliquées dans le mécanisme. On savait déjà que la chromatine doit jouer un rôle dans l'interférence chez les plantes. NR Dudley et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (02APR02) 4191-4196.
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8. Les régions centromériques sont, en général, une lacune dans les séquences génomiques, car constituées de répétitions. On peut essayer de se rapprocher progressivement des bords de ces régions pour en analyser la structure. C'est ce qui a été fait au voisinage du centromère du chromosome X humain. (MG Schueler et al.; Science 294 (05OCT01) 109–115) article commenté dans S Henikoff; Trends in Genetics 18 (APR02) 165-167.
On constate alors qu'il existe, dans la région péricentromérique, un gradient de répétitions appelées að-satellites, qui sont des répétitions de séquences d'environ 171 pb. Certaines de ces séquences ont évolué, d'abord par amplification, puis par mutations et insertions. Chaque chromosome humain a ses particularités dans ces séquences que l'on retrouve chez d'autres primates. D'autres sont restées relativement stables. Ce que l'on peut observer indique que les répétitions les plus jeunes sont proches du centromère. L'échelle de cette évolution est de l'ordre de 60 millions d'années.
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Les Productions Végétales
Les gènes et les génomes
7. Il existe plusieurs riz Oryza sativa, l'un de régions plutôt chaudes, indica, (avec accessoirement javanica) et l'autre plus septentrional, O.sativa japonica. Ce génome a un intérêt plus large, car c'est le plus petit génome des céréales et on devrait pouvoir l'utiliser pour déchiffrer celui du blé.
Des chercheurs de Beijing, Fudan, Zhejiang et Shangai rassemblés dans un énorme consortium de séquençage et aidés par l'University of Washington Genome Center publient une ébauche de la séquence du génome de 466 Mb (dont 433 d'euchromatine) du riz indica. J Yu et al.; Science 296 (05APR02) 79-92.
La séquence de ce riz a été obtenue par la technique du shotgun global du génome entier (voir le §1) de la variété 93-11 et avec des machines MegaBACE 1000, à 10-11 séquences quotidiennes mais sans précisions sur le nombre des machines utilisées). Cette variété est le parent mâle d'un riz hybride hyperproducteur (30% de plus que les riz usuels), Liang-You-Pei-Jiu (LYP9), le parent femelle étant Pei-Ai 64s (PA64s).
L'assemblage couvre actuellement 92 % du génome. Environ 42,2% de ce génome sont constitués de répétitions d'oligomères de 20-nucléotides, et la plupart des transposons qui ont survécu sont localisés entre les gènes. Bien que 80,6% des gènes d'Arabidopsis aient une contrepartie chez le riz, seuls 49,4% des gènes du riz se retrouvent chez Arabidopsis. La présence d'un gradient de la teneur en G+C, de codons utilisés et d'acides aminés différents pourrait expliquer cette absence de l'homologie et permet une analyse de l'évolution du riz et probablement des autres céréales. La séquence est libre d'accès au http://btn. genomics.org.cn/rice ainsi qu'au DNA Data Bank of Japan/European Molecular Biology Laboratory/GenBank sous l'accession AAAA00000000. La version analysée dans l'article est AAAA01000000.`
Le riz Pei-Ai 64s (PA64s) est essentiellement un indica, mais avec des contributions mineures de riz japonica et javanica. Il a été également, mais partiellement, séquencé et ne peut, pour l'instant, être utilisé que pour avoir une idée du polymorphisme. Le stade où ils en sont peut être déduit de l'article, notamment pour les ESTs.
L'International Rice Genome Sequencing Project (IRGSP) travaille sur le génome de la variété bien connue Nipponbare du riz japonica. Ce consortium utilise la technique du séquençage par clones BACs (voir §1 ) et PACs (P1-derived Artificial Chromosomes).
De leur côté Monsanto et Syngenta ont également établi une ébauche "privée" en Avril 2000 et Février 2001. Dans ce cas, la séquence Monsanto a aidé à compléter la séquence de l'IRGSP. Une ébauche de 93% de la séquence est publiée par les chercheurs du Torrey Mesa Research Institute de Syngenta (SA Goff et al.; Science 296 (05APR02) 92-100, consultable apparemment au www.tmri. org). Ils estiment à 420 Mb la taille du génome et de 32 000 à 50 000 le nombre de gènes probables. On y trouve des homologues de 98 % des gènes connus du maïs, de l'orge et du blé. La firme annonce, dans son Press Release (04APR02) que l'analyse porte sur 99% du génome avec une précision de 99.,8% (!), dès ce stade, et que 4 000 caractères agronomiques ont pu être identifés. Syngenta espère l'aide de la recherche publique pour obtenir une version finale exacte à 99,99%. Elle sera déposée à GenBank.
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8. Le Biozentrum, l'Université de Basel et Syngenta viennent de séquencer le génome du champignon pathogène Ashbya gossypii. La très petite taille de ce génome (9 Mb sur 7 chromosomes) est intéressante en soi. Les auteurs ont détecté 4720 séquences codant des protéines. Syngenta Press Release (05APR02).
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9. Le gène codant la protéine S13 de la sous-unité ribosomale mitochondriale est généralement présent dans le génome mitochondrial, mais on ne le trouve pas dans celui de la mitochondrie d'Arabidopsis. On l'a donc recherché dans le génome nucléaire, et on ne l'y a pas trouvé. En réalité il existe bien dans le noyau, mais sous une forme modifiée, copiée sur le gène correspondant chloroplastique. La perte d'un exon est associée à l'absence du peptide ciblant vers le plaste, remplacé par un peptide permettant le ciblage vers la mitochondrie. C'est ce qu'ont montré des chercheurs de l'INRA à Versailles. P Mollier et al.; Current Genetic 40 (MAR02) 405–409.
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L'expression génique
11. Un facteur de transcription de type bZIP du tabac, BZI-1, se fixe bien sur les éléments de type G-box et C-box des promoteurs des gènes de la voie des phénylpropanoïdes dans des essais in-vitro, mais n'est pas impliqué dans leur régulation. C'est un avertissement concernant les déductions un peu hâtives de fonction. T Heinekamp et al.; Molecular Genetics & Genomics 267 (MAR02) 16-26.
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Le développement
13. Les cépages de vigne sont reproduits par greffe, et sont donc des clones, ce qui n'empêche pas des mutations d'apparaître de temps en temps. Le Pinot noir dérive d'un cépage ancien probablement cultivé depuis plus de 2 000 ans. Le Pinot Meunier en est dérivé, à son tour, vers 1500, (ces deux Pinot sont les seuls raisins noirs autorisés, pour la production du champagne, avec le blanc Pinot Chardonnay) mais, s'il en est indistinguable génétiquement dans la plupart des cellules, il porte une mutation dans les cellules de la couche L1 de l'épiderme donnant une surface de feuille tomenteuse (velue). Le méristème apical contient deux couches appelées L1 (extérieure) et L2 (voir le § 289 du Bulletin d'Avril 2001 par exemple). Ce caractère est conservé par le greffage qui utilise toujours le méristème avec son organisation structurale et génétique. Des chercheurs australiens viennent de caractériser cette mutation qui n'est autre que celle du semi-nanisme (Reduced height-1) qui a permis la "révolution verte" en accroissant les rendements du blé. PK Boss et al.; Nature 416 (25APR02) 847-850. Voir le § suivant)
Les auteurs ont produit, par régénération des deux couches cellulaires L1 et L2, des plants dont toutes les cellules expriment ou non la mutation. On a, alors, constaté le semi-nanisme chez celles dérivant de L1. Ceci a orienté les recherches, chez ces mutants, vers un gène de type GAI [GA INSENSITIVE pour insensibilité à l'acide giberellique (GA) d'Arabidopsis]. C'est un gène régulateur, appelé par les auteurs VvGAI1, (Vitis vinifera GA-insensitive), freinant la croissance de la plante et dont l'effet est annulé en présence de GA. Une mutation laisse le frein serré, même si on applique du GA, et les plantes sont naines. Ceci n'est évidemment visible que si toutes les cellules sont mutantes. Dans le cas du Pinot Meunier cette mutation est limitée à la couche L1 et la mutation libère du freinage par GA les cellules engendrant les poils.
La mutation est ponctuelle, une histidine plus volumineuse substituée à une leucine, et semi-dominante. Elle a été localisée dans le domaine DELLA commun à toutes les protéines régulatrices commandées par GA. (DELLA correspond à Asp-Glu-Leu-Leu-Ala).
Une autre partie du phénotype des plantes régénérées est saisissant. Normalement, la vigne produit des fleurs à l'opposé des premières nouvelles feuilles et des vrilles face aux feuilles plus tardives (en réalité face à 2 sur 3 de ces feuilles). Elles dérivent de méristèmes caulinaires particuliers dits "non déterminés". Or, chez les plants régénérés à partir de L1, les vrilles sont converties en inflorescences. Ceci indique que les vrilles correspondent à une répression de la formation des inflorescences sous l'action de GA. On savait que le GA a une action sur la floraison chez d'autres plantes, notament chez Arabidopsis, mais ceci est un nouvel effet. Les vrilles ont, cependant, une origine diverse. Ainsi, chez le pois, ce sont des folioles modifiés. Chez la vigne ce sont des inflorescences modifiées.
Des pulvérisations de gibberellines sont utilisées pour accroître artificiellement la taille des grains dits "seedless". Or contrairement à ce que l'on pouvait prévoir, la taille des grains des plantes régénérées L1 est normale. Ceci est dû au fait que VvGAI1 n'est pas exprimé dans les grains et n'a donc pas de rôle dans sa croissance. Les graines des plantes mutantes régénérées sont quasiment indéfiniment.dormantes. Il faut, pour les faire germer, les scarifier et les traiter au GA3. Voir , également, le commentaire de DR Smyth; p. 801.
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14. L'asymétrie dorsoventrale de la corolle d'Antirrhinum dépend de l'expression des gènes CYCLOIDEA (CYC) et DICHOTOMA (DICH) dans les pétales dorsaux. L'un des rôles des produits de ces gènes est de réprimer l'expression du gène d'identité ventrale DIVARICATA (DIV). Cette identité se répand dans tous les pétales chez les double-mutants cyc;dich. DIV est une protéine de type Myb, c'est à dire un facteur de transcription, qui affecte la croissance des pétales latéraux et ventraux au débût de leur expansion, alors qu'il est exprimé dans tous les pétales. Il est transcrit plus tard seulement dans une couche cellulaire des pétales ventraux et latéraux. Son absence d'effet dans les pétales dorsaux n'est pas liée à une redondance et il est vraisemblablement régulé post-transcriptionnellement sous l'effet de CYC et DICH. Cette divergence tardive dépend de l'activité de DIV, car des mutants où la protéine est inactive ne montrent pas ce patron. L Gallego et al.; Genes & Development 16 (01APR02) 880-891.
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15. L'architecture de l'inflorescence d'Arabidopsis dépend, en partie, du développement des pédicelles. Les mutants brevipedicellus (bp) ont, sur un fond génétique Landsberg erecta, un phénotype particulier avec une inflorescence compacte, évidemment, et des fleurs inclinées vers le bas. Le gène code une protéine à homéodomaine, KNAT1, de la famille KNOX (knotted-like homeobox). Ces mutants peuvent correspondre à des délétions, comme bp-1, ou à des mutations ponctuelles, comme bp-2. Les effets sont multiples, portant à la fois sur la cadence des divisions, et sur le développement des cellules épidermiques et corticales, surtout dans la partie abaxiale des organes, ainsi que sur le développement de la fleur elle-même, au niveau du style.
ST Venglat et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (02APR02) 4730-4735.###
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16. Le gène SUPERMAN code probablement un régulateur du développement floral. On vient de montrer que c'est effectivement un répresseur du type actif, dont la fonction réside dans le domaine C-terminal. Son expression permanente entraîne un nanisme sévère sans toucher à la taille cellulaire, ce qui laisse à penser qu'il régule l'activité de gènes intervenant dans les divisions cellulaires entraînant une activation des divisions cellulaires. K Hiratsu et al.; FEBS Letters 514 (13MAR02) 351-354.
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17. Le rôle des protéines G hétérotrimériques (trois sous-unités Gað et Gbðgð)ð ða été peu étudié chez les plantes. Ces protéines sont classées, ailleurs , en quatre groupes principaux: les Gs (activant les adénylate cyclases) les Gi (les inhibant), les Gq (activant la phospholipase C) et les G12 (activant probablement la phospholipase D). Ce sont des interrupteurs moléculaires associés à des récepteurs transmettant le signal apporté par le ligand, fonctionnels sous la forme liée au GTP, et non-fonctionnels sous la forme GDP. La Gh (activant la phospholipase C) est un peu à part, avec un site de fixation du GTP atypique, qui fonctionne comme une transglutaminase dans la position "on".
La seule protéine de ce type, identifiée jusqu'à présent chez Arabidopsis thaliana, est la sous-unité Gað ð ðcodée par GCR1 (encore que cette fonction reste à démontrer).
Sa surexpression entraîne deux phénotypes intéressants : perte de la dormance de la graine et période de floraison avancée dans l'année. Les marqueurs moléculaires de fonctionnement de ces deux mécanismes (phosphatase PP2A et MYB65 lors de la germination; et LFY pour la floraison) sont exprimés lors de la surexpression de GCR1. GCR1 est, probablement, un régulateur du cycle cellulaire qui a un patron d'expression voisin de celui de la cycline D2. G Colucci et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (02APR02) 4736-4741.###
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18. Un gène intervenant sur le patron des nervures des feuilles a été caractérisé par des chercheurs coréens. Ce gène, VEP1 (pour VEin Patterning) code une protéine qui contient un motif dit Death Domain qui, chez les Mammifères, est présent dans des protéines intervenant dans l'apoptose et permet l'adhésion des composants du complexe induisant ce suicide cellulaire. Il a été caractérisé au sein d'une collection de mutants induits par l'expression d'antisens grâce à des Agrobacterium recombinants. JH Jun et al.; Plant & Cell Physiology 43 (MAR02) 323-330.
Une expression réduite du gène entraîne une réduction de la complexité du patron des nervures des feuilles.
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La Physiologie des Plantes
20. La variété semi-naine de riz IR8 est l'équivalent des variétés de blé de la "révolution verte". Le gène du blé Rht (reduced height) correspond à un gain de fonction causé par une mutation dans un facteur de transcription associé à la transduction du signal GA. Dans le cas d'IR8, la stature réduite est liée à une mutation dans le gène SD1. C'est une mutation dans une oxydase, la GA20 oxydase (GA20ox-2), impliquée, cette fois, dans la production des giberrellines (GA), et non dans la perception et la transmission du signal. On peut en effet atténuer le phénotype par une pulvérisation de GA. C'est donc une perte de fonction. A Sasaki et al.; Nature 416 (18APR02) 701-702.
La GA20ox catalyse les trois étapes de la production GA53>GA44>GA19>GA20 et son gène est porté sur le bras long du chromosome 1 du riz. La mutation sd1 correspond à une délétion de 383 pb (que l'on retrouve dans une variété japonaise naine) et qui induit un changement de phase lors de la traduction.
Il existe deux gènes codant cette enzyme mais les périodes et la localisation de l'expression sont différentes. Voir le §13 sur la vigne.
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21. On trouvera dans X Wu et al.; Genes & Development 16 (15JAN02) 151-158, une revue sur les signaux mobiles ARNs et peptidiques transmis, chez les plantes, par les plasmodesmes qui permettent de considérer une plante comme un organisme supracellulaire.
On a ainsi pu montrer que des facteurs de transcription doivent certainement circuler dans la plante, et que des ARNs doivent constituer des signaux à grande distance.
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23. La nicotine du tabac n'est pas seulement destinée à rendre "accro" les fumeurs, mais est, avec la nornicotine et l'anabasine, un métabolite secondaire de défense de la plante avec, également, un rôle probable dans la régulation de la croissance de la plante. Elle est accumulée dans la feuille, avec l'acide salicylique, mais en proportions variables et indépendantes.
Des tabacs produisant de l'acide salicylique en permanence voient leur accumulation de nicotine diminuée après une infection par le virus de la mosaïque du tabac, alors que les blessures la stimulent. On n'observe aucun effet du virus sur l'accumulation de nicotine dans des tabacs non-transgéniques, mais les blessures (comme l'étêtage des inflorescence classiquement pratiqué avant la récolte) entraînent le même effet stimulateur avec une synthèse dans la racine et un transport vers les feuilles. L'acide jasmonique est un acteur dans cette dernière régulation après blessure et l'effet est contré par l'acide salicylique. LH Nugroho et al.; Plant Science 162 (APR02) 575-581
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24. Les sucres ne sont pas seulement des molécules à contenu énergétique, ce sont aussi des signaux. Le glucose et des dérivés du saccharose (le sucre central) naturels comme les isomères palatinose et turanose, et artificiels, comme le fluoro-saccharose, ont été utilisés pour démêler les différentes voies de signalisation aboutissant dans les sites sources et puits du saccharose, dans la photosynthèse, et l'activation des MAPKs (Mitogen-Activated Protein Kinases). L'opération a été réalisée dans des cellules autotrophes de la tomate sauvage Lycopersicon peruvianum. Les résultats indiquent que les sucres métabolisables ont des effets sur ces phénomènes qui sont différents de ceux qui ne sont pas métabolisables, en particulier sur la petite sous-unité (à codage nucléaire) de la Rubisco. Saccharose et glucose inversent source et puit, et inhibent la photosynthèse. Les sucres non métabolisables activent fortement les MAPKs, ce qui n'est pas le cas pour saccharose et glucose. Ceci entraîne une plus rapide activation de ces enzymes, sous l'action d'un éliciteur de Fusarium oxysporum lycopersici en présence des sucres non métabolisables qui apparaissent comme des générateurs de stress cellulaire. AK Sinha et al.; Plant Physiology 128 (APR02) 1480-1489.
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26. Les gènes codant les sucrose phosphate synthases (SPS) des plantes "supérieures" appartiennent à au moins trois familles. Ces enzymes interviennent dans la synthèse du saccharose, catalysant la conversion du fructose 6-phosphate et de l'UDP-glucose en saccharose 6-phosphate, la sucrose phosphate phosphatase (SPP) clivant ce dernier en saccharose et phosphate inorganique. Chez Arabidopsis, on trouve deux gènes de la famille A sur le chromosome 5 (la duplication semblant récente), un de la famille B sur le chromosome 1 et un de la famille C sur le chromosome 4. Cette organisation se retrouve chez les membres d'une même famille de plantes. G Langenkämper et al.; Journal of Molecular Evolution 54 (2002) 322–332. Les auteurs ont également analysé les gènes de Citrus et d'Actinidia. Ils suggèrent que ces différentes formes doivent avoir, probablement, des fonctions un peu différents. On s'en douterait.
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Les Symbioses
27. La nature et la production des messages échangés entre un Rhizobium et la plante qu'il nodule sont bien connues, alors que leur régulation l'est moins.
Sinorhizobium meliloti produit un facteur Nod, entraînant la formation des nodules par la plante, ainsi qu'un succinoglycane permettant l'invasion de la plante par la bactérie. Le ppGpp est un facteur régulateur bien connu de ce que l'on appelle la réponse stringente, c'est à dire une réponse à une carence en acides aminés chez la bactérie. Cette réponse de type stress intervient dans la nodulation et induit la production du succinoglycane fonctionnel qui est, en réalité, un produit de fragmentation d'un gros polymère qui facilite la formation des cordons infectieux. DH Wells et al.; Molecular Microbiology 43,n°5 (MAR02) 1115–1127.
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28. Huit groupes de gènes conférant la tolérance au sel des Rhizobium tropici à l'état libre, sont également nécessaires à une symbiose fonctionnelle avec le haricot Phaseolus vulgaris. J Nogales et al.; Molecular Plant Microbe Interactions 15 (MAR02) 225-232.
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29. Lors de la symbiose entre un Rhizobium et la plante qu'il nodule, des acides dicarboxyliques en C4 sont les seules sources de squelettes carbonés transmis en quantités suffisantes de la plante à la bactérie pour permettre la fixation, coûteuse en énergie, de l'azote. Il s'agit du malate issu de la carboxylation du phosphoenolpyruvate (PEP) en oxaloacétate puis réduit par la malate déshydrogénase. Les acides dicarboxyliques en C4 sont pompés par le bactéroïde et envoyés vers le cycle tricarboxylique.
L'essentiel de l'azote fixé en ammoniaque est envoyé vers la plante (l'alanine est également transférée), mais une partie est conservée par le bactéroïde et assimilé grâce à deux enzymes, alanine déshydrogénase et glutamate déshydrogénase fonctionnant sur 2-oxoglutarate chez Sinorhizobium meliloti.
Le rôle du glutamate, présent en grandes quantités dans les nodules reste énigmatique. Il se pourrait que ce soit lié à l'inhibition, au cours de la symbiose, du complexe de la 2-oxoglutarate déshydrogénase qui convertit le 2-oxoglutarate en succinyl-CoA dans le cycle tricarboxylique de Krebs. Le glutamate, en effet, dérive de l'oxoglutarate par amination (à partir de l'azote assimilé) par une glutamate déshydrogénase, ou transamination à partir d'une molécule aminée grâce à une transaminase acceptant l'oxoglutarate.
Une dérivation du glutamate ainsi accumulé pourrait être la voie du shunt du GABA (gð-aminobutyrate) qui entraîne une décarboxylation par la glutamate décarboxylase du glutamate en GABA. Le groupement amine de GABA est alors transférable ailleurs par une GABA aminotransférase pour donner du succinate après oxydation, ce qui contourne un blocage éventuel au niveau de la 2-oxoglutarate déshydrogénase. Ceci a été déduit de différentes observations mais n'avait pas pu être confirmé, faute de mutants adéquats.
On vient de caractériser un gène de GABA aminotransférase de Rhizobium leguminosarum bv.viciae, le gène gabT. Il pourrait intervenir dans ce shunt. Les mutants de gabT sont encore capables de vivre sur GABA comme seule source de carbone et d'azote. Ces mutants ne possèdent pas de GABA-aminotransférase, mais les transferts à partir du pyruvate persistent. Il existe donc probablement deux enzymes impliquées dans le métabolisme du GABA. Chez la bactérie libre le gène est induit par la présence de GABA et réprimé par le succinate sous l'action de GabR. J Prell et al.; Microbiology 148 (FEB02) 615–623.
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30. Les champignons ectomycorhiziens colonisent les racines de plus de 80% des plantes. En conditions de stress hydrique ou de carence en minéraux, le champignon sait mieux s'en sortir que la plante qu'il aide, ainsi, en lui transférant une partie de ses prélèvements.
Il est difficile de les étudier à l'état isolé, car ce sont des biotrophes qui ne se cultivent qu'étroitement associés aux racines de leur plante hôte. Des Gigaspora et Glomus intraradices peuvent, cependant germer et pousser en boite de Petri, en présence de racines de carotte, tomate ou trèfle. On n'a cependant pas isolé les composés qui permettent ces cultures. Ils germent et poussent sur de l'agar, mais pas longtemps.
La flore du sol, notamment les bactéries dénommées PGPRs (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria), intervient certainement dans la croissance des hyphes et la formation de la symbiose. On a montré, récemment, que des Burkholderia vivent endosymbiotiquement dans les spores de Gigaspora et que des Paenibacillus sont associés à Glomus mosseae dans la rhizosphère de Sorghum bicolor et y facilitent la symbiose mycorhizienne. C'est le cas de Paenibacillus validus qui permet la croissance de Glomus intraradices sur agar. U Hildebrandt et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (APR02) 1919-1924.
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31. On trouve souvent à la surface des feuilles des colonies roses de méthylotrophes facultatifs classés comme Methylobacterium. Les bactéries semblent vivre du méthanol émis par les stomates. On ne sait pas trop quel est le statut de cette association (commensale, symbiotique, etc…). On sait, par exemple, que ces bactéries stimulent les arômes de la fraise, par exemple. Une séquence partielle de Methylobacterium extorquens AM1 est disponible à http://pedant.mips.biochem.mpg.de, ce qui devrait permettre de mieux cerner les aspects biologique de cette association. En effet un certain nombre d'ORFs (séquences potentiellement codantes) se retrouvent chez les Rhizobacterium et Agrobacterium. Une des caractéristiques de l'association est la stimulation de la régénération de plantes en présence des bactéries, et celle de la germination de certaines graines (soja), ce qui fait penser à une fourniture, par la bactérie, de cytokinines à la plante. On vient de montrer qu'ils sont capables de produire de la trans-zéatine (une cytokinine) à partir d'ARNs de transfert capturés au cours de leur dégradation. Ce qui est original est que, chez les autres bactéries, on observe de la cis-zéatine. RL Koenig et al.; Journal of Bacteriology 184,n°7 (APR02) 1832-1842###.
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Les Pathogènes des Plantes et les Mécanismes de Défense
32. Le Tomato bushy stunt virus est l'un des rares virus à ARN des plantes qui peut se déplacer dans toute la plante en l'absence de sa protéine de capside. La protéine virale p19 n'intervient pas non plus dans cette mobilité, mais est un facteur de virulence. En fait, chez Nicotiana benthamiana les deux protéines complémentent leurs actions respectives. La protéine de capside permet une décharge du génome à partir du système vasculaire tandis que p19 supprime les défenses classiques de type "virus-induced gene silencing". F Qu et al.; Molecular Plant Microbe Interactions 15 (MAR02) 193-202.
La protéine p19 (P19) du Tomato bushy stunt virus est un déterminant de la pathogénicité du virus. L'un de ses rôles principaux est de contrer la réponse de défense aux virus en général, consistant en un PTGS (PostTranscriptional Gene Silencing) du virus (ele est encore plus efficace pour des gènes hétérologues). W Qiu et al.; Molecular Plant Microbe Interactions 15 (MAR02) 269-280.
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33. La protéine virale VPg liée de façon covalente en amont du brin codant du génome des potyvirus (Potato Y Virus étant le prototype) régule l'accumulation et le chargement des virions dans le phloème des plantes, mais c'est aussi la protéine qui rend abortives certaines infections (avirulence). Une étude sur le Potato virus A (PVA) chez Solanum commersonii montre qu'une seule substitution d'acide aminé (His118Tyr) dans VPg entraîne une perte de la résistance au virus. D'autres substitutions en position 116 et 185 ont également un effet. Cette substitution est spécifique d'hôte. ML Rajamaki et al.; Molecular Plant Microbe Interactions 15 (FEB02) 138-149.
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34. Le gène d'une MAPKinase (Mitogen-Activated Protein Kinase) de Magnaporthe grisea, PMK1, régule la formation des appressoria et la croissance des hyphes de ce champignon pathogène du riz. PMK1 est l'homologue de FUS3 et KSS1, des gènes qui régulent le gène STE12 du facteur de transcription chez la levure.
Des chercheurs ont donc recherché et isolé l'homologue de STE12 chez M.grisea (MST12). Ils ont ensuite construit quatre mutants mst12 de délétion de ce gène. Quatre mutants de délétion mst12 ont été isolés. Bien qu'aucun phénotype de croissance de conidiation ou de germination des conidie ne soient décelable chez ces mutants, ils sont avirulents sur riz et orge. Alors que les mutants pmk1 ne forment plus d'appressoria, les mutants mst12 forment des appressoria typiques, mais qui ne sont pas capables de percer les parois de cellules épidermiques d'oignon et, quand on les introduit de force, les lésions ne s'étendent pas. MST12 doit donc fonctionner en aval de PMK1 pour réguler le fonctionnement de gènes intervenant dans la croissance des hyphes infectieux. G Park et al.; Molecular Plant Microbe Interactions 15 (MAR02) 183-192.
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35. Une RNase S-like du tabac (RNase NE) inhibe, in vitro, l'élongation des hyphes de Peronospora parasitica à partir des zoospores, et de Fusarium oxysporum à partir des conidies.
La RNase NE est extracellulaire aux débuts de l'interaction, face aux extrémités des hyphes dans la paroi. Des chercheurs de l'INRA à Antibes ont, en effet, produit cette RNase chez Pichia pastoris et l'ont utilisée contre ces deux champignons. C'est bien l'activité RNasique qui est en cause. Le parallèle avec l'inhibition des tubes pollliniques au cours de l'auto-incompatibilité reproductrice est faite. K Hugot et al.; Molecular Plant Microbe Interactions 15 (MAR02) 243-250.
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36. La protéine MLO est associée aux défenses de l'orge contre Blumeria (alias Erisyphe) graminis f. sp. Hordei, mais sous une forme mutée. La mutation mlo a été largement utilisée dans la sélection classique pour transférer des résistances au mildiou. Elle fait partie des défenses dues à des mutations dans des gènes (donc récessives et correspondant probablement à des pertes de fonctions) dans des gènes dont les fonctions restent souvent à préciser. C'est une protéine membranaire à sept domaines transmembranaires, mais qui n'est pas associée à une G-protéine hétérotrimérique classique dans ce type de récepteur qui ne sont apparemment pas nombreux chez les plantes (voir le §17). C'est la calmoduline qui régule l'activité de cette protéine. MC Kim et al.; Nature 416 (28MAR02) 447-450.
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37. Les petites protéines liant le GTP de la famille RAC jouent un rôle dans la transduction des signaux dans le cytosol. Une protéine homologue de RacB chrez l'orge intervient dans l'entrée du mildiou Blumeria graminis f.sp. hordei H Schultheiss et al.; Plant Physiology 128 (APR02) 1447-1454. On a pu le montrer en utilisant une interférence ARN en exprimant une forme ARN double brin de son gène de façon à inactiver ses messagers. Dans ce cas la formation des haustoria est inhibée. Cette fonction est liée à celle de MLO.
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38. Un traitement par l'acide salicylique inhibe, chez le tabac, la réplication et les déplacements de plusieurs virus à ARN codant (ARNs sens). Cette résistance peut être également stimulée par du cyanure ou de l'antimycine A à des doses non léthales, et ceci sans déclencher la production des protéines PR-1 (Pathogenesis-Related-1). Il en est de même chez Arabidopsis thaliana pour un virus voisin de celui de la mosaïque du tabac, le Turnip vein clearing virus (TVCV). Dans les deux cas ce mécanisme est indépendant de NPR1 (voir le §40) qui intervient usuellement en aval de l'acide salicylique. Cette résistance, qui porte sur le mécanisme initial de la réplication, utilise donc une autre voie qui doit agir en parallèle avec la voie classique. CE Wong et al.; Molecular Plant Microbe Interactions 15 (JAN01) 75-81.
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39. Le tubercule de la pomme de terre produit localement une protéine antimicrobienne de 66 aminoacides après les étapes de maturation. C'est la snakine 2 décrite par des chercheurs de Madrid. Elle est exprimée lors d'une blessure ou d'une attaque par Botritys cinerea que la plante supporte sans trop de dommages, mais cette réponse est atténuée par les bactéries virulentes Ralstonia solanacearum et Erwinia chrysanthemi. Elle n'est exprimée au cours du développement que dans les parties aériennes de la plante, ainsi que dans le tubercule, mais pas dans les stolons ce qui est curieux, car c'est à partir de ces derniers, qui sont également des tiges souterraines, que se développe le tubercule. Cette protéine est probablement impliquée dans les défenses permanentes et induites. M Berrocal-Lobo et al.; Plant Physiology 128 (MAR02) 951-961
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40. La résistance systémique induite est une prévention active de la plante "prévenue" d'une attaque quelque part. On peut la déclencher avec des composés mimant l'acide salicylique, comme le benzothiadiazole (BTH) qui sert d'alerte du système de défense. On vient de montrer que ce prémoniteur a besoin du gène NPR1/NIM1 d'Arabidopsis pour être fonctionnel. (NPR1 pour Non producer of PR1, et NIM1 pour Non inducible IMmunity 1, les gènes étant comme souvent dénommés selon la mutation qui a permis de les caractériser, dans ce cas par une absence de réponse de type salicylate). La protéine présente des similitudes troublantes avec l'inhibiteur du facteur de transcription NF-kB appelé I-kB, souvent mentionné dans ce bulletin. Elle est impliquée, en effet, dans la voie de réponse faisant intervenir le salicylate. On constate qu'après un prétraitement par le BTH, la PAL (Phenylalanine Ammonia Lyase) et le dépôt de callose sont accélérés dès la première attaque de Pseudomonas syringae pv. Tomato ou une blessure. On retrouve cette réponse chez des Arabidopsis exprimant en permanence les gènes PR (cpr) où la réponse de type salicylate est permanente. A Kohler et al.; Plant Physiology 128 (MAR02) 1046-1056.
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42. Des gènes hrp de Ralstonia solanacearum codent un système de sécrétion de type III (sécrétant diverses molécules liées à la virulence, mais déclenchant également les défenses de l'hôte). L'expression de ces gènes est régulée par la protéine HrpB, lorsque la bactérie "sent" la plante. Ceci est lié à une interaction physique entre bactérie et plante-hôte et perçu par le récepteur PrhA localisé dans la membrane externe de la bactérie. On trouve en aval de PrhA une cascasde de transmission de signaux impliquant PrhJ, HrpG et le susdit HrpB. Les chercheurs du groupe INRA/CNRS de Toulouse ont identifié deux gènes, prhI et prhR, parmi le groupe de gènes hrp. Ces deux gènes régulent l'activation des gènes hrp, mais leur expression ne dépend pas d'un signal perçu par PrhA dans le milieu. PrhIR agit en amont de PrhJ et en aval de PrhA, et ceci vraisemblablement dans le périplasme de la bactérie. La cascade franchit donc, judicieusement les trois compartiments à partir de signaux non diffusibles de la paroi de la plante cible. B Brito et al.; Molecular Plant Microbe Interactions 15 (FEB02) 109-119.
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43. Une infection donne souvent lieu à un jeu de taquin, comme ce bulletin en mentionne souvent, où l'organisme réagit à la présence d'un pathogène en lançant des défenses, le pathogène cherchant à passer inaperçu, ou à déprimer les défenses, ou à les tourner à son profit. On peut maintenant y ajouter la possibilité pour l'hôte de se rendre compte qu'on est en train de le manipuler. C'est ce que l'article du groupe de Dangl, D Mackey et al.; Cell 108 (22MAR02) 743-754 vient illustrer. Ils ont étudié la réaction d'Arabidopsis à Pseudomonas syringae. Le gène RPM1 lui permet de résister spécifiquement lorsque la bactérie exprime les protéines d'avirulence AvrRpm1 ou AvrB.
En effet ces deux protéines sont reconnues par la protéine RIN4 de la plante qui se fixe sur elles. Ce qui est nouveau, c'est que cette fixation entraîne une phosphorylation de RIN4. Mais, chez les plantes sensibles, ceci entraîne une production accrue de la protéine et une stimulation de son activité qui a pour effet de déprimer les défenses de la plante.
Les plantes résistantes décèlent la formation du complexe phosphorylé grâce à la protéine de résistance, RPM1 qui, au contraire, déclenche le branle-bas avec la réaction hypersensible (nécrose localisée qui crée un désert métabolique pour l'intrus), mais avec RIN4 comme partenaire, ce qui complique les choses, l'interaction entre les élicicteurs bactériens étant indirecte avec RPM1 via RIN4. La réduction du niveau de RIN4 entraîne une réduction de ceux de RPM1 et une baisse de la résistance à la fois à Pseudomonas, mais aussi à Peronospora parasitica. RIN4 est donc à la croisée des chemins entre sensibilité et résistance et c'est RPM1 qui aide à la discrimination.
RIN4 stimule donc la résistance via RPM1, mais c'est un régulateur négatif des défenses générales. La phosphorylation renforce cette deuxième fonction. Voir également le commentaire illustré de PJGM de Wit; Nature 416 (25APR02) 801-803.
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44. L'oca (Oxalis tuberosa) est un des multiples tubercules consommés dans les Andes. La protéine la plus abondante dans ses réserves (40 à 60% des protéines de réserves) est l'ocatine qui vient d'être purifiée et caractérisée. T Flores et al.; Plant Physiology 128 (APR02) 1291-1302.
Elle possède une masse moléculaire apparente de 18 kDa. Elle est uniquement présente dans la moelle et dans dans le périderme du tubercule. C'est un antibactérien actif sur Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Serratia marcescens et Pseudomonas aureofaciens et antifongique actif sur Phytophthora cinnamomi, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani et Nectria hematococcus. Cette protéine ressemble beaucoup à plusieurs protéines PR (Pathogenesis Related proteins) aux fonctions actuellement inconnues.
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46. Des chercheurs de Louvain ont exprimé, chez Arabidopsis, un transgène chimérique codant une polyprotéine clivable liant deux protéines antifongiques, DmAMP1 des graines de Dahlia merckii et RsAFP2 de celles du radis Raphanus sativus avec un peptide de liaison interposé provenant d'une polyprotéine naturelle de la balsamine, Impatiens balsamina. Le montage permet la sécrétion des deux protéines dans l'espace périplasmique après clivage. L'expression est supérieure à celle des protéines exprimées individuellement. IE François et al.; Plant Physiology 128 (APR02) 1346-1358.
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47. Il existe une série de gènes qui, après mutation, s'expriment en permanence et en l'absence de pathogène généralisent la réaction hypersensible sans aucune nécessité (paranoia végétale). C'est les cas de LSD1 d'Arabidopsis et LLS1 (Lethal Leaf Spot 1) du maïs. La répression de l'expression de l'homologue de la tomate de LLS1 du maïs entraîne une incapacité à limiter la croissance des lésions dans certaines conditions (en présence de lumière, comme chez le maïs).
En effet, ce phénomène de nécrose est lié à la formation de radicaux oxygène réactifs et facilite la photo-oxydation. Cette réaction est normalement limitée par la production de molécules anti-oxydantes. LSD1 intervient précisément dans la production d'une superoxyde dismutase, tandis que LLS1 code une dioxygénase. L'inhibition a été réalisée en utilisant la technique de "virus induced gene silencing". S Spassieva et al.; Plant Science 162 (APR02) 543-549.
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Les Plantes recombinantes
49. Des chercheurs italiens ont eu l'idée de rendre fluorescents les pétales de fleurs en y exprimant la GFP, ce qui est facile, mais le problème est d'exciter la fluorescence à travers les tissus. Ils ont donc utilisé des fleurs transparentes aux UV excitateurs, soit pour toute la fleur d'Eustoma grandiflorum (alias Lisianthus russellianus, une Gentianacée), soit pour la seule cuticule des pétales avec Osteospermum ecklonis (une composée qu'on trouve dans les jardins méditerranéens. Les auteurs étendent leurs travaux à l'utilisation de chromophores activables à des longueurs d'onde plus grandes. A Mercuri et al.; Plant Science 162 (APR02) 647-654.
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50. Environ 65% du phosphore récolté sous forme de phosphates dans le monde sont consacrés aux engrais. Les plantes produisent de l'ordre de 51 millions de tonnes d'acide phytique. On trouvera dans H Brinch-Pedersen et al.; Trends in Plant Science 7 (MAR02) 118-125, une revue sur l'ingéniérie génétique des plantes pour améliorer l'utilisation des phosphates. Elle concerne largement les phytases en vue de construire des plantes fournissant plus efficacement des phosphates aux animaux monogastriques, sans entraîner d'eutrophisation.
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Les Insectes et leur Maîtrise
52. Les extrapolations possibles du génome de Drosophila melanogaster vers ceux des moustiques Aedes albopictus et le vecteur du paludisme, Anopheles gambiae sont discutées dans ED Eccleston et al.; Insect Molecular Biology 11 (APR02) 187-195.
C'est un exercice qui a porté sur une protéine énigmatique de 52 kDa d'Aedes albopictus. Des navettes avec les banques de données ESTs ont montré que son produit de traduction se retrouvait chez Anopheles gambiae, Caenorhabditis elegans et Drosophila melanogaster. Les séquences des ESTs ont permis de combler les trous dans la séquence du gène d'Aedes avec les données de Drosophila, et les auteurs ont fini par établir une séquence complète. La digestion de la protéine de 52 kDa en peptides analysés par spectrométrie de masse a confirmé la séquence.
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53. Les chironomides ont toujours été des insectes amusants. Chironomus tentans (le ver de vase des pêcheurs) ne possède pas de télomérase. On retrouve cependant des complexes ARN-ADN avec des répétitions typiques de télomères, mais indépendants des chromosomes. M Rosen et al.; Insect Molecular Biology 11 (APR02) 167-174. Voir également M Rosen et al.; Chromosome Research 10(JAN02) 21-31, pour la structure des télomères, en effet les télomères constitués de courtes répétitions ont généralement des extensions simple-brin riches en Gs, qui sont également absentes de ces télomères.
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54. La transformation du vecteur de la fièvre jaune, Aedes aegypti, par le transposon piggyBac de Trichoplusia ni (un Lépidoptère) est décrite dans NF Lobo et al.; Insect Molecular Biology 11 (APR02) 133-139. On commence à avoir transformé beaucoup de diptères avec ce vecteur.
Les auteurs ont utilisé le gène cinnabar de Drososphila melanogaster comme marqueur et transformé des embryons au stade préblastoderme par injection. Une fréquence de transformation de 4% avec une fluctuation de 0 à 13% est indiquée. La transposase était fournie grâce à un plasmide thermoinductible. Le phénotype est stable sur plus de 20 générations. Pour ceux que l'acharnement à transformer des insectes vecteurs étonne, je rappelle que le but de ces opérations est de créer des éléments d'une lutte biologique, un insecte résistant peut prendre la place d'un insecte vecteur.
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55. Ne vous frottez pas aux femelles… du staphylin (coléoptère) Paederus car elles produisent une toxine irritante, la paedérine. C'est une molécule polycyclique dont on trouve des analogues chez des éponges comme Mycale, Stylinos,Theonella. En dehors de ce pouvoir irritatoire (selon Queneau) ce sont des antitumoraux et antiviraux potentiels. Elles doivent cette propriété intéressante à des bactéries endosymbiotiques. Ces bactéries ont été caractérisées par un chercheur du Fraunhofer Institut für Toxikologie und Aerosolforschung. RLL Kellner; Insect Biochemistry and Molecular Biology 32 (APR02) 389–395.
Ce sont des gð-Protéobactéries voisines des Pseudomonas sensu-stricto comme Ps.æruginosa. Elles doivent avoir le même rôle dans la production des mycalamides chez les éponges.
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56. La mouche tsé-tsé est un des insectes vecteurs de maladies animales. Glossina palpalis transmet le trypanosome de la maladie du sommeil en Afrique. Comme souvent, la mouche en souffre aussi d'une autre façon et développe des défenses. Ce sont, entre autres des peptides antimicrobiens plus ou moins spécifiques.
Glossina morsitans est un vecteur, elle, de Trypanosoma brucei brucei. On avait, jusqu'à présent surtout attribué les défenses de la mouche tsé-tsé contre les protozoaires à des mécanismes liés aux lectines. Des protéines attacin-like et cecropin-like ont été détectées dans l'hémolymphe, lors d'une infection par E.coli. Les chercheurs du CNRS à Strasbourg, qui ont beaucoup fait pour l'analyse de ces défenses, notamment chez la drosophile, ont révélé l'induction d'une cécropine, d'une attacine et d'une défensine lors d'une infection par Trypanosoma brucei brucei.. N Boulanger et al.; Insect Biochemistry and Molecular Biology 32 (APR02) 369–375. Une diptericine produite en permanence dans le corps gras avait également été détectée par une autre équipe l'an passé.
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57. Neutraliser l'odorat des insectes piqueurs est un des moyens de réduire la fréquence des interactions avec ses hôtes. C'est pourquoi on poursuit des études sur les récepteurs de l'odorat chez ces insectes. Des protéines du vecteur du paludisme, Anopheles gambiae, liant les molécules odorantes, sont en cours de caractérisation chez Inscent d'Irvine (Cal.) avec l'aide des chercheurs de l'Université. Elles ressemblent beaucoup à celles d'autres insectes liant soit les molécules odorantes banales, soit les phéromones. Elles sont exprimées dans les deux sexes et on retrouve quelques unes de ces protéines chez d'autres moustiques, Aedes aegypti et Culex quinquefasciatus.H Biessmann et al.; Insect Molecular Biology 11 (APR02) 123-132.
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58. Les sons émis lors de la cour nuptiale des insectes, sont un instrument d'isolement reproductif. Un gène, appelé cacophony (cac), avait été isolé chez la Drosophile et ses mutations entraînent une modification du son émis.C'est très probablement un gène d'un canal calcium influant sur le fonctionnement global du système nerveux, car des muations thermosensibles entraînent des convulsions à 37°. Les phlébotomes (vecteurs des Leishmanioses, si je me rappelle bien), et dont le représentant méditerranéen "pappatacci" que je hais à cause de son vol silencieux et de sa voracité (le nom signifie en corse "manges et tais toi") a un gène homologue qui permet d'étudier les populations.
On vient d'analyser l'évolution de ces pestes au niveau d'une des régions conservées du gène cac qui a été comparée à la région homologue de la drosophile. RM Lins et al.; Insect Molecular Biology 11 (APR02) 117-122. Les auteurs ont également constaté que ces moustiques petits et velus ont perdu un intron présent chez la drosophile.
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59. La structure génétique d'une population de l'acarien Tetranychus urticae a été étudiée par des chercheurs de l'INRA à Montpellier et de l'Université de Dijon dans une serre, sur deux ans. Elle est finalement très homogène dans le temps et l'espace, indiquant que les acariens sont manifestement mobiles et échangent des gènes, l'inbreeeding diminuant en fonction de la densité des populations. M Navajas et al.; Insect Molecular Biology 11 (APR02) 157-165.
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60. Il se pourrait que les prostaglandines soient impliquées dans la physiologie du tube digestif d'un insecte comme Manduca sexta car tous les gènes de production sont présents dans l'intestin moyen. K Buyukguzel et al.; Insect Biochemistry & Molecular Biology 32 (APR02) 435-443.
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Les Biopesticides
62. La toxine insecticide, active sur les moustiques Culex quinquefasciatus et Aedes aegypti, (MTX) de Bacillus sphaericus SSII-1 (une souche à faible toxicité) ressemble beaucoup aux ADP-ribosyltransférases bactériennes. Des chercheurs de Freiburg ont étudié l'activation protéolytique de l'enzyme. Le précurseur de 97 kDa (MTX30-870, le peptide signal de 29 aa exclu) est actif sur C.quinquefasciatus clivé ou pas. Il est,cependant, clivé en un fragment de 70 kDa de fixation (MTX265-870), plus un fragment enzymatique de 27 kDa (MTX30-264) possédant les glutamates catalytiques classiques, ici en position 195 et 197. On peut également cliver un fragment N-terminal de 32 kDa (MTX30-308) en fragment enzymatique MTX30-264. L'activité ADP-ribosyltransférase est nettement plus forte que celle du précurseur MTX30-870. L'association non-covalente des deux éléments 70 et 27 kDa inactive l'enzyme. Celle-ci, exprimée dans des cellules de mammifères,se révèle toxique pour elles, ce qui n'était pas connu. J Schirmer et al.; Journal of Biological Chemistry 277 (05APR02) 11941-11948.
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63. Bien que Bacillus thuringiensis soit utilisé comme bioinsecticide depuis le début du XX° siècle et relativement massivement dans certaines occasions, seuls des cas cliniques sporadiques ont été observés chez l'homme. Cette bactérie est pourtant difficilement distinguable de Bacillus cereus qui est pathogène pour l'homme (voir le §129).
Des chercheurs danois ont étudié des personnels travaillant dans des serres utilisant, ou pas, ce biopesticide et ont comparé leur flore fæcale. Ils ont identifié les bactéries par les séquences espaceurs 16S-23S et recherché les gènes d'entérotoxine (voir 6 ) d'une part et les dð-endotoxines.
Ils ont trouvé ceux des B.thuringiensis porteurs des gènes de la dð-endotoxine. La bactérie peut donc coloniser, au moins temporairement le tube digestif humain, apparemment sans pathologie décelable. GB Jensen et al.; International Archives of Occupational and Environmental Health 75 (MAR02) 191-196.
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Les Productions animales
Les génomes
65. La force de la sélection animale classique a été de pouvoir, grâce à la génétique quantitative, de bâtir des stratégies de sélection sans connaître le mécanisme sous-jacent. On passe progressivement à une stratégie utilisant des marqueurs, sans signification directe pour un mécanisme biologique, pour préciser la localisation et la nature d'une information de type QTLs qui est lourde à établir. Ceci permet de construire des stratégies physiologiques.
Le groupe de Michel Georges à Liège, en collaboration avec deux équipes néozélandaises, a cartographié un QTL important pour la composition du lait avec, notamment, un effet sur le taux butyreux. B Grisart et al.; Genome Research 12 (FEB02) 222-231. Le gène d'une acylCoA:diacylglycérol acyltransférase (DGAT1) est localisé au voisinage immédiat de ce QTL, et il est très vraisemblablement responsable de son effet. La démonstration est faite qu'il est possible de réaliser un clonage positionnel chez un mammifère "outbred" et pas "inbred" comme la plupart des lignées de laboratoire de souris.###
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67. La région génomique contenant les gènes des récepteurs olfactifs de la souris est située juste en amont des segments Vað des loci aðdð ðdes récepteurs des cellules T (TCR). On y détecte six gènes de récepteurs olfactifs chez la souris, et cinq chez l'homme, et ces cinq se retrouvent chez la souris. Le sixième résulte d'une duplication d'environ 10 kb. L'un des gènes communs est vraiment très voisin dans sa séquence dans les deux espèces (plus qu'avec les autres gènes de l'espèce). Il y a certainement une raison à cette pression de sélection manifeste. Les promoteurs de ces gènes ont été comparés. Ils sont apparemment différents au sein d'une espèce, ce qui est curieux vu leur co-expression. RP Lane et al.; Genome Research 12 (JAN02) 81-87.
Les auteurs remarquent également qu'un site de recombinaison, d'un des gènes de TCR–að en aval, se situe au sein des gènes des récepteurs olfactifs. Ceci pourrait indiquer que les récepteurs olfactifs utilisent cette recombinaison dans les neurones olfactifs, pour diversifier leur répertoire, mais les auteurs n'en ont pas trouvé trace.
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La transformation des cellules animales
68. Le transposon Sleeping Beauty issu de poissons a été utilisé pour transformer des embryons de Mammifères au stade unicellulaire. AJ Dupuy et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (02APR02) 4495-4499. Ce transposon est un transposon synthétique reconstitué à partir d'éléments transposables Tc1/mariner de poissons, inactifs à la suite de mutations accumulées (Z Ivics et al.; Cell 91 (14NOV97) 501-510). Ces transposons sont intéressants, car ils fonctionnent indépendamment de facteurs de l'hôte, et ont donc un large spectre d'hôtes.
On avait démontré une transposition dans des cellules-souches embryonnaires ES, des cellules somatiques et des cellules germinales de souris. SEJ Fischer et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98 (05JUN01) 6759-6764.
La transposase SB a été, dans le cas de l'article de Dupuy et al., fournie sous la forme de messagers injectés.
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Le développement
69. Le blocage de la maturation des ovocytes est un événement assez spectaculaire chez les mammifères. On vient de révéler un nouvel acteur dans ce mécanisme. Il y a, en réalité, plusieurs pauses dans ce développement, la dernière étant celle, bien connue, de la métaphase II de la meïose, qui ne pourra être levée que par la fécondation. On connaissait, depuis 30 ans, le rôle du CSF (CytoStatic Factor) défini par le fait que son injection dans une cellule bloque aussi bien mitose que meïose. La protéine Mos fait partie du complexe CSF. Mais la voie CSF-Mos est inactivée après la fécondation qui déclenche la reprise de la maturation. On a donc des raisons de penser qu'il existe un élément inconnu dans cette voie qui bloque la maturation. On vient de montrer qu'une protéine régule la dégradation des protéines impliquées dans l'arrêt du développement, Emi1. JDR Reimann et al.; Nature 416 (25APR02) 850-854.###
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70. La progestérone induit la maturation des ovocytes. La protéine kinase A (PKA, une kinase cAMP-dépendante) est un puissant inhibiteur de cette maturation. On vient de montrer que cet effet est indépendant de l'activité kinase et même des sous-unités régulatrices de PKA. A Schmitt et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (02APR02) 4361-4366. Des formes catalytiquement inactives bloquent également l'action de Mos.
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71. Chez la souris l'asymétrie droite/gauche commence par être exprimée au niveau de l'expression de nodal, lefty2 et pitx2 dans la partie gauche du mésoderme latéral au moment de la neurulation. Un nouveau gène, celui de la rotatine, indispensable à une expression réglementée de nodal, lefty et pitx2,vient d'être caractérisé. L'absence de la rotatine entraîne non seulement une orientation aléatoire des viscères, mais encore un délai dans la fermeture du tube neural. C'est une protéine membranaire. AM Faisst et al.; Mechanisms of Development 113 (APR02) 15-28.
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72. La nature même des cellules "souches" adultes est en perpétuelle réévaluation. L'utilisation des cellules souches embryonnaires pose des problèmes éthiques, et donc de nature différente. On propose donc, et pour cette raison, d'utiliser les cellules adultes. Or ce n'est pas si évident qu'on ne le pensait il y a deux ans. Un commentaire de N deWitt et al.; Nature 416 (28MAR02) 354, traite de ce problème.
Ce bulletin a, à plusieurs reprises, cité des articles qui affirmaient que des cellules souches sanguines existent dans plusieurs tissus, alors que la croyance générale est qu'elles ne peuvent dériver que de la moelle osseuse, par exemple et, inversement, on a affirmé que ces cellules de la moelle osseuse peuvent donner toutes sortes d'autres types cellulaires.
Le phénomène de la transdifférenciation est donc l'objet de débâts intenses. Une des hypothèses est la fusion de cellules qui pourrait expliquer certains des résultats….
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73. FGF18 est nécessaire à la prolifération et la différenciation des chondro- et ostéoblastes. Il joue un rôle positif pour l'ossification et négative dans la chondrogenèse. Il est également nécessaire dans l'ossification directe des mésenchymes comme dans les os craniaux où il n'y a pas de chondrogenèse. N Ohbayashi et al.; Genes & Development 16 (01APR02) 870-879.
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74. Les ostéoclastes proviennent des monocytes/macrophages. Leur différenciation dépend de RANKL (Receptor Activator of NF-kB Ligand, un membre de la famille du TNF pour Tumour Necrosis Factor) agissant sur son récepteur RANK. Il doit être très strictement régulé sous peine de voir le squelette se défaire à tout propos. Mais on ne sait absolument pas si le signal transmis est régulé de quelque façon.
On vient de montrer que RANKL induit le gène de l'interféron bð (IFN-bð) ainsi que celui de c-Fos dans les précurseurs des ostéoclastes, sans que le mécanisme exact soit connu. IFN-bð inhibe cette différenciation en interférant avec l'expression de c-Fos, qui est un facteur de transcription nécessaire à la différenciation des ostéoclastes. Usuellement la production de l'interféron bð ðest induite par des infections virales, mais c'est, ici, une utilisation entièrement différente, et faisant intervenir c-fos et son induction par RANKL, qui est révélée. Ainsi c-Fos induit son propre inhibiteur. Il semble d'ailleurs que l'ensemble du système des interférons að/ðbð intervienne dans l'homéstasie de la masse osseuse. H Takayanagi et al.; Nature 416 (18APR02) 744-749.
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La Physiologie
76. La leptine stimule directement la thermogénèse dans les muscles squelettiques. Ceci requiert les récepteurs de la forme longue de la leptine et la voie de la phosphatidylinositol 3-kinase. AG Dulloo et al.; FEBS Letters (27MAR02) 109-113.
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77. L'analyse du promoteur du gène de l'hormone de croissance de la truite a permis de révéler une régulation modulaire. Chez les Vertébrés, la sécrétion de la GH requiert le facteur de transcription pituitaire (spécifique de l'hypophyse) Pit-1/GHF1. Celui-ci est responsable du développement des cellules somatotropes, lactotropes et thyrotropes de l'adénohypophyse, et du déclenchement de la production respective des hormones correspondantes, hormone de croissance, prolactine et thyrotropine.
Comme tous les facteurs POU dont il est un des prototypes (Pit-1, Oct-1 et -2 Unc-86), il est fortement conservé parmi les Vertébrés. Son action est modulée par une foule de facteurs adjuvants comme le récepteur des œstrogènes, ceux de l'hormone thyroïdienne, de l'acide rétinoïque, ou de la vitamine D, la protéine Zn-15 ou Ets-1. Il est également modulé par le cAMP et les glucocorticoïdes. C'est le cas chez la truite. Pit-1 se fixe sous forme de dimère sur trois sites à haute affinité dans la région -226/+24. La protéine CREB (cAMP response element (CRE)-binding protein) se fixe sur l'élément CRE situé entre les deux sites Pit1 distaux. Tous ces sites jouent des rôles différents acquis au cours de l'évolution.
Un module critique associant Pit-1 au site proximal est suffisant pour donner lieu à une production de base de la GH. Cette production est stimulée par les deux autres sites après occupation par le même Pit-1 et activée par cAMP et glucocorticoïdes, respectivement. F Argenton et al.; Molecular and Cellular Endocrinology 189 (28 MAR02) 11-23.
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78. Des chercheurs de Montréal ont analysé la diversité étonnante des séquences ADN répondant aux œstrogènes dans le génome humain, via les récepteurs de ces hormones (Ers). Les éléments palindromiques classiques ne sont présents que dans quelques uns des gènes activés, alors que des séquences hémi-palindromiques à faible affinité sont présentes dans la plupart des autres gènes activés. Ces séquences doivent accepter d'autres récepteurs nucléaires via des adaptateurs. Une revue sur le sujet est parue avec R Sanchez et al.; BioEssays 24 (MAR02) 244254.
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79. La ghreline, produite dans l'estomac et également présente dans l'hypothalamus, active la sécrétion de l'hormone de croissance (GH).Voir à ce sujet le Bulletin de Mars §82. Sa régulation a été étudiée récemment. YL Liu et al.; Molecular and Cellular Endocrinology 189 (28 MAR02) 97-103.
Les observations indiquent que la ghreline joue un rôle dans la croissance et le métabolisme des jeunes, puis dans la sécrétion sexuellement dimorphique de la GH chez les adultes.
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80. Le rôle de l'olfaction dans les relations humaines est un sujet débattu, mais pas tranché. L'odeur des individus est, on le sait, liée au complexe MHC (HLA pour Human Leucocyte Antigen chez l'homme).
Chez les rongeurs elle intervient dans plusieurs aspects du comportement, dont le choix du partenaire. On pense que les odeurs perçues lors de l'enfance sont importantes pour les préférences ultérieures, mais on a des arguments pour un élément génétiquement transmissible. Un article, S Jacob et al.; Nature Genetics 30(FEB02) 175-179, travaillant sur une population avec un faible nombre d'allèles HLA ont pu établir que les femmes préfèrent les odeurs de mâles proches de la leur, mais surtout celle des individus qui ont des allèles semblables à ceux hérités de leur père, et à ceux-la seulement (pas tous les allèles du père). C'est manifestement une empreinte génétique.
Les résultats ressemblent beaucoup à ceux décrits chez la souris, l'an passé, par AR Isles et al.; Nature 409 (15FEB01) 783-784 (voir le Bulletin d'Avril 2001).
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Le système immunitaire
81. L'interaction d'une cellule B porteuse d'un récepteur d'autoantigène (auto-réactive) avec cet antigène entraîne, soit une délétion clonale, soit une inactivation. Ceci permet l'immunotolérance. L'inactivation fonctionnelle, est aussi appelée anergie dans le cas des cellules B périphériques.
On vient de montrer que la protéine kinase Cdð ð(PKC-dð) est nécessaire à cette immunotolérance. Son absence entraîne la formation d'anticorps anti-ADN et antinucléaires dans le sérum. Cette absence ne perturbe pas les réponses des cellules B immunogéniques. Elle ne perturbe, également, pas le développement des lignées B et T, mais les ganglions lymphatiques et la rate sont hypertrophiés chez les souris qui sont dépourvues de PKC-dð,ð du fait de l'amplification des populations de cellules B et des cellules érythroïdes.I Mecklenbraüker et al.; Nature 416 (25APR02) 860-865 et A Miyamoto et al.; p.865-869.
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82. Le rôle des neutrophiles dans la phagocytose des intrus est connu depuis longtemps. Ils sont également appelés granulocytes, du fait de la présence de granules qui sont déchargés dans les vacuoles résultant de la phagocytose. On pensait depuis longtemps, également, que la destruction des cellules phagocytées était due à la production d'ions superoxydes.
Le peroxyde d'hydrogène pourrait alors servir de substrat pour des réactions d'halogénation, grâce à des myéloperoxydases. Les granulocytes contiennent également des protéases, élastase et cathepsine G, dont l'absence abaisse les défenses contre bactéries et champignons.
EP Reeves et al.; Nature 416 (28MAR02) 291-297 viennent de montrer que si les souris dépourvues de ces deux enzymes sont incapables de juguler certaines infections, leurs neutrophiles sont normalement fonctionnels et "crachent" des oxygènes réactifs comme prévu. Mais ce n'est pas la production de ces molécules réactives qui tue les microbes. Ce que les auteurs ont mis en évidence, c'est que les protéases sont adsorbés sur une matrice très dense dans les granules et sont ainsi maintenues inactives. La cathépsine est, par ailleurs, très sensible aux oxydations. Elles vont être libérées par la charge osmotique de la vacuole qui croît à la suite du choc oxydatif qui est accompagné par un basculement du pH de la vacuole. Celui-ci devient nettement alcalin (passant de ph6 à 8, ce qui est précisément le pHopt des protéases par ailleurs normalement plongées dans le milieu acide des granules), ce qui est lié au fait que les protons sont consommés pour neutraliser les ions superoxydes basiques, et que des ions potassium entrent dans la vacuole. Ceci associé aux débris des cellules ingérées rend la vacuole hypertonique. Une entrée lente d'eau vient ensuite corriger ce déséquilibre, mais le gonflement des vacuoles ne se fait pas, à cause du cytosquelette qui corsette la vacuole.
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84. Les cellules T "naïves" (non stimulées par l'antigène pour lesquelles elles sont programmées) sont au repos dans les conditions normales, mais elles sont rapidement amplifiées quand les lymphocytes viennent à manquer pour une raison ou une autre. Ce ne sont pas des cellules "mémoires" comme on le pensait du fait que les cellules T naïves sont au repos et que les cellules mémoires se répliquent rapidement. Chez les animaux nouveaux-nés, les premiers thymocytes matures migrent dans des zones où les cellules T sont absentes. Des chercheurs de Necker-Enfants malades ont examiné leur comportement en fonction de l'âge. Comme dans les souris lymphopéniques les cellules T du nouveau-né prolifèrent abondamment. Les premières cellules émigrantes atteignant la périphérie ont besoin d'une interaction à faible affinité entre leur récepteur et les complexes réunissant des peptides "self" associés au MHC "self", analogue à celle entraînant la sélection positive dans le thymus. Cette prolifération est régulée par la taille de la population des cellules T périphériques. A Le Campion et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (02APR02) 4538-4543.
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85. On trouvera dans AS MacDonald et al.; Infection and Immunity 70 (FEB02) 427–433, une revue sur l'immunologie des helminthiases. Ces maladies ont été à peu près éradiquées dans les pays développés, mais restent un problème préoccupant dans la plupart des autres pays.
La réponse immunitaire est très semblable face à des vers qui ont des cycles de vie très différents. C'est une réponse de type Th2 avec production de quantités importantes d'interleukines comme IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 et IL-13 qui entraînent le développement d'une forte réponse IgE, des éosinophiles et des cellules du système réticulo-endothélial. La réponse Th2 est souvent la cause de fibroses, notamment vasculaires. Mais ces effets sont souvent mal compris, et on décèle également des effets probables dûs au système Th1.
Les systèmes qui ont été les plus étudiés sont la schistosomiase, les filarioses (oncocercoses en particulier), souvent dans des systèmes modèles. On est cependant handicapé par le fait que les filaires comme Brugia ou Wuchereria n'arrivent pas à développer jusqu'au bout leur cycle chez la souris. Cependant on a récemment établi un modèle basé sur la filaire murine Litosomoides sigmodontis. Le rôle des Wolbachia (bactéries symbiotiques souvent mentionnées à propos des insectes) dans la pathologie est probablement sous-estimé dans la pathogenèse de ces vers, notamment par son intervention dans les phénomènes inflammatoires destructeurs de ces infections.
Dans ce type d'infections souvent chroniques, on observe un équilibre entre cytokines calmant le jeu comme IL-4 et IL-10, d'autres comme IL-13 qui induisent des fibroses peuvent, en l'absence d'Il-4 (coproduite avec IL-13 par les cellules Th2) entraîner des inflammations léthales.
Dans les filariases ou schistosomiases on observe une réaction importante des cellules T puis celle-ci s'amenuise, et tant mieux pour le patient. On admet qu'IL-10 joue un rôle clé dans la régulation de l'intensité des réponses des cellules Th1 et Th2 face à ces parasites et empêche une immunopathologie fâcheuse.
Une autre caractéristique des infections helminthiques est qu'il existe une prémunition par une première infection contre une réinfection par la même espèce, ce qui se traduit par le fait que les individus âgés sont beaucoup moins affectés que les individus plus jeunes. Comment cela se passe-t-il? On n'en sait trop rien, sinon que la réponse Th2 y contribue. Les individus dépourvus d'IL-4 ne montrent pas d'immunité de ce type.
L'expulsion des parasites intestinaux (et donc la contagion) est étroitement liée à la capacité de réponse Th2.
Les vaccins contre ces parasites sont peu nombreux et si un vaccin contre la schistosomiase est essayé chez l'homme, l'efficacité semble limitée. Il y a d'ailleurs plus de vaccins vétérinaires (notamment contre les nématodes ou contre Tænia ovis) qu'humains. Il est vrai qu'on accepte de prendre plus de risques chez les animaux. La complexité de la réponse immunitaire qui empêche encore d'en avoir une vue globale, ses aspects négatifs, font qu'on travaille pas mal de façon empirique à partir d'une idée.
La revue traite également des astuces d'évasion immunitaire chez ces parasites.
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86. On trouvera dans CO Cunningham et al.; Aquaculture 206 (29MAR02) 19–55, une revue sur les outils moléculaires de diagnostic des pathogène des poissons et mollusques.
Elle résume les méthodes publiées pour les maladies mentionnées dans la réglementation européenne et surtout cellles concernant le nord de l'Europe. Beaucoup de ces méthodes mériteraient des vérifications supplémentaires.
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87. La peau, comme d'autres épithéliums, a un rôle de barrière, mais aussi de défense, et elle sécrète des peptides antimicrobiens appelés cathélicidines qui ont été découverts dans les années 90. On les trouve également dans d'autres épithéliums, comme ceux des poumons et de l'intestin. Cette production est assurée par différents types cellulaires épithéliaux, mais aussi par les macrophages. En effet les neutrophiles neutralisent des pathogènes intracellulaires avant que leur nombre ne déborde les défenses cellulaires. Les cathélicidines font partie de leur arsenal. On en a récemment découverts dans la sueur. C Potera; ASM News (12MAR02) 108.
Leur action bactériocide a été vérifiée sur des streptocoques A (V Nizet et al.; Nature 414 (22NOV01) 454-457). Ils n'ont pas découvert de souches résistantes, et pourtant ces bactéries sont au contact de la peau depuis fort longtemps, car les séquences sont conservées, non seulement chez l'homme, mais encore chez plusieurs autres mammifères.
Des chercheur de Tübingen (B Schittek et al.; Nature Immunology, 12 (DEC01) 1133-1137) ont caractérisé la dermcidine des glandes sudoripares. C'est une protéine de 9,3 kDa de 110 aminoacides qui ne possède guère d'homologie avec des séquences connues. Elle est active sur Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus et Candida albicans dans des condition physicochimiques correspondant bien à celles de la peau.
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Les Vaccins
88. Des chercheurs israéliens ont étudié les effets d'une immunisation passive post-exposition aux spores de Bacillus anthracis. De telles immunisations passives avec des sérums d'animaux vaccinés ont été utilisées au début du XX°siècle, mais ont été abandonnées pour manque d'efficacité. Ils utilisent des sérums polyclonaux anti-PA et anti-LF (Lethal Factor qui est un des deux composants de la toxine de la bactérie, anti-Sterne (une souche toxinogénique vaccinale et anti-PA monoclonaux. Ils semblent satisfaits des résultats. D Kobiler et al.; Infection and Immunity 70 (FEB02) 544–550.
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89. Les vaccins acellulaires actuellement utilisés contre la maladie du charbon causée par Bacillus anthracis sont basés sur l'antigène protecteur ou PA (voir, à ce sujet le Bulletin de Juillet 2001, §142) car c'est le composant permettant la fixation sur la cellule et l'introduction de la toxine. On a, parfois des effets secondaires liés à la présence de traces des deux facteurs proprement toxiques. On peut utiliser des formes tronquées recombinantes de PA conservant le domaine C-terminal et on protège relativement bien des souris. Comme le montrent des chercheurs de Porton Down. HC Flick-Smith et al.; Infection and Immunity 70 (MAR02) 1653–1656.
Malheureusement, chez l'animal, ces vaccins sont moins efficaces que des souches atténuées vivantes. Des spores inactivées au formaldéhyde associées au PA sont beaucoup plus efficaces, au moins chez la souris et le cochon d'Inde. Les auteurs (de l'Institut Pasteur) font remarquer que les deux animaux ont des réactions très différentes aux souches non toxinogéniques de la bactérie. F Brossier et al.; Infection and Immunity 70 (FEB02) 661–664
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Les Pathogènes
90. La première séquence complète d'un génome bactérien date à peine de 1995. On en possède actuellement à peu près 60. Une revue sur la biodiversité microbienne basée sur les séquences connues est parue dans RF Doolittle; Nature 416 (18APR02) 697-700. Les tailles varient de quelques centaines de kb pour les mollicutes (alias mycoplasmes) à 8 millions pour Mesorhizobium loti. On a d'ailleurs maintenant pris en compte les éléments génétiques stables comme les mégaplasmides, ce qui n'est que logique. Ceci recouvre le spectre des eucaryotes avec le génome minimal de 3 Mb pour une microsporidie (Encephalitozoon cuniculi, un parasite unicellulaire). Le contenu en gènes (avec les réserves d'usage) donne également lieu à recouvrement entre eu- et procaryotes. M.loti en possède environ 8 000, alors que Saccharomyces cerevisiae en possède environ 6 200 et la microsporidie environ 2 000. Dans tous les cas, la technique shotgun a parfaitement fonctionné (voir le §1). La surprise a été le nombre de gènes sans fonctions connues.
Quelles bactéries ont été séquencées? Evidemment les bactéries pathogènes, et encore pour l'homme. Cela représente les trois-quarts des séquences achevées. Il existe cependant plusieurs séquences de bactéries industriellement, environnementalement ou agronomiquement intéressantes. Les archées sont intéressantes aux deux derniers points de vue, et on espère trouver des choses insoupçonnées car, auparavant, on ne les distinguait pas des bactéries et on extrapolait parfois de façon un peu trop hardie. Une toute petite archée vient d'être séquencée par le groupe de Stetter, et je reviendrai sur cet article du 5Mai de Nature.
Chez l'archée Aeropyrum pernix, on observe 1 500 ORFs, séquences potentiellement codantes, dont 57% n'ont pas de fonctions annotées ailleurs. C'est également le cas de 40% des 4 000 ORFs de Mycobacterium tuberculosis, pourtant une des bactéries pathogènes très étudiées.
Beaucoup d'études ont été consacrées aux transferts horizontaux (d'une espèce bactérienne à une autre, voire à des organismes supérieurs) dont on a observé très souvent des traces avant les séquençages totaux, mais dont l'importance a été nettement sous-estimée. Le rôle des virus et des plasmides était connu. Le fait que des gènes concernant des fonctions données soient souvent regroupés sur les chromosomes bactériens facilite les transferts de fonctions au delà des séquences. C'est probablement une conséquence de la sélection pour des fonctions, la bactérie ne pouvant se payer de stocker des séquences, en cas… Ce bel ordre est souvent perturbé par les facéties des éléments transposables et les recombinaisons inévitables. La transposition intervient dans le transfert de groupes de séquences co-localisées d'un chromosome à un plasmide de passage, et participe aux transferts.
Beaucoup d'efforts et de publications ont été consacrées à ce qui rend les bactéries pathogènes, à commencer par la légendaire transformation de Streptococcus pneumoniae décrite en 1944 et qui associait la pathogénicité à la production d'une capsule dont les gènes étaient transférables par transformation directe avec de l'ADN de souches pathogènes. La séquence a permis de montrer que ce sont une douzaine de gènes qui sont nécessaires à son élaboration et doivent être transférés.
Le regroupement fonctionnel de gènes se retrouve dans les îlots de pathogénicité. Ils peuvent être de grande taille, comme dans le cas d'Helicobacterium pylori, agent des ulcères de l'estomac, ou un îlot de 40 kb est présent. L'existence de ces îlots était connue avant les séquençages complets, mais on peut maintenant analyser leurs composants.
Les publications récentes sur les systèmes de sécrétion de type III (tellement innombrables que j'ai renoncé à les lire de façon plus ou moins exhaustive), montrent qu'ils sont présents dans des génomes minimaux comme celui de Chlamydia trachomatis, un parasite intracellulaire causant le trachome, jusque dans le génome géant de Mesorhizobium loti.
Dans les séquences d'Escherichia coli ou Salmonella, ces ilôts sont encadrés par des séquences d'insertion indiquant une origine transpositionnelle, avec des séquences codant les ARNs de transfert, qui doivent résulter d'une insertion préférentielle dans ce type de séquences.
Les souches de Pseudomonas aeruginosa sont de deux types, a et b, dont seul le type a possède des protéines flagellaires glycosylées. Ceci est lié à la présence d'un îlot de pathogénicité de 16 kb et 14 gènes implantée dans une énorme séquence gouvernant la production des flagelles. Le type b possède un îlot plus petit avec trois gènes de fonctions inconnues, strictement au même site. Ces deux cassettes peuvent être échangées par recombinaison.
Bacillus anthracis contient deux gros plasmides dont un présente un îlot de 44,5 kb contenant les gènes codant la toxine flanqué de séquences inversées. Le plasmide porte également une collection de transposases et intégrases, qui ne sont peut être pas toutes fonctionnelles.
Toutes ces séquences de type îlot ne présentent cependant pas des gènes de pathogénicité et la notion d'îlots n,'est pas superposable avec virulence, mais… M.loti présente, ainsi, un îlot symbiotique de 600 kb et 580 gènes flanqué par des répétitions de 17 pb et utilise une des codons différents de celle du reste du génome, ce qui indique une origine étrangère.
Sinorhizobium meliloti, possède un chromosome bien plus petit et deux plasmides, mais on y retrouve le même îlot sur l'un des deux.
La perte de gènes par les pathogènes animaux est frappante et informative. Chez Rickettsia prowazekii, l'agent du typhus, 25% de la séquence a perdu toute capacité de codage, alors que cette proportion ne dépasse pas 10% usuellement chez les bactéries. On retrouve bien plusieurs pseudogènes, qui indiquent l'origine de ces séquences non codantes. La réduction des génomes est donc en cours. Chez Mycobacterium leprae, la moitié de ce génome conséquent est non codante et contient 1 100 pseudogènes. Chez M.tuberculosis, ce n'est pas le cas et la comparaison des deux génomes est intéressante, car la plupart de ces 1 100 gènes sont apparemment fonctionnels chez M.tuberculosis. La comparaison des séquences indique que la divergence est récente entre ces deux bactéries, et la réduction a dû avoir lieu sur une courte période de temps.
Les fonctions perdues sont diverses, et dépendent des bactéries. Dans certains cas c'est la production des métabolites essentiels, cas de Mycoplasma genitalium un pathogène urogénital et Borrelia burgdorferi, agent de la maladie de Lyme transmise par les tiques de la forêt de Fontainebleau (entre autres). Dans le cas de Rickettsia et Chlamydia, c'est la production de l'ATP qui a disparu, et ceci a été compensé par une ATP translocase (inconnue chez les autres bactéries jusqu'à nouvel ordre, sauf peut être dans le chloroplaste) qui leur permet de pomper ce carburant dans les réservoirs de la cellule parasitée. Cette stratégie se retrouve chez le petit eucaryote intracellulaire, Encephalitozoon cuniculi.
La réduction des génomes n'est pas synonyme de pathogenèse mais se retrouve chez les bactéries symbiotiques des pucerons comme les Buchnera, souvent mentionnées dans ce bulletin et qui ne peuvent vivre l'un sans l'autre.
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91. Bordetella bronchiseptica cause la rhinite atrophique ainsi que des pneumonies du porc. Elle produit plusierus facteurs de virulence dont des toxines. Un article analyse le rôle de la toxine dermonécrotique (DNT) de la bactérie dans l'atrophie nasale. C'est bien un facteur important non seulement de la rhinite, mais également des pneumonies. SL Brockmeier et al.; Infection and Immunity 70 (FEB02) 481–490.
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92. Une nouvelle toxine à activité ADP-ribosyltransférase a été caractérisée chez le pathogène des poissons, Aeromonas salmonicida subsp.salmonicida en sus de Corynebacterium diphtheriæ de la diphtérie, Vibrio choleræ du choléra, Pseudomonas aeruginosa et Bordetella pertussis de la coqueluche. Elle est dénommée AexT (pour Aeromonas exoenzyme T). C'est elle qui cause la furonculose des saumons et des truites et qui est un problème important pour les élevages. Son gène a été cloné et la séquence de la toxine a été déduite.
AexT présente de fortes similitudes de séquences avec les exotoxines ExoS et ExoT de Pseudomonas aeruginosa (avec lesquelles elle présente une réaction immunologique croisée) et la cytotoxine YopE de différentes Yersinia. Elle n'est exprimée qu'en présence de cellules de poisson. M Braun et al.; Journal of Bacteriology 184,n°7 (APR02) 1851-1858.
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93.Les trypanosomes africains peuvent exprimer plusieurs gènes à leur surface (variation antigénique) mais ne le font que pour un seul (exclusion allélique). Ils le font en amenant le gène à s'exprimer dans un corps nucléaire particulier. On peut se poser la question pour d'autres cas d'exclusion allélique. Le gène de la protéine principale de l'enveloppe du trypanosome (variant surface glycoprotein ou VSG) est transcrit à partir d'une longue unité transcriptionnelle logée dans un site télomérique. Le millier d'autres gènes pouvant coder cette protéine sont regroupés dans des domaines non-télomériques et subissent une transposition, résultant d'une conversion génique, de temps à autre entraînant une variation antigénique. On observe, par ailleurs la formation d'une centaine de minichromosomes de 50–100 kb portant un gèneVSG à leur extrémité. Ces derniers peuvent envahir le site d'expression soit par conversion génique, soit par recombinaisons réciproques. Ces deux types de réarrangements sont facilités par de petits blocs d'homologies entre sites donneur et receveur. Dans ces conditions un seul site d'expression est suffisant.
La surprise a été de découvrir que Trypanosoma brucei s'en paye une vingtaine.
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Les Productions Microbiennes
95. Lactobacillus sakei est une bactérie non pathogène souvent présente sur les produits carnés, et on l'utilise, avec L.curvatus, pour la protection de ces produits contre les contaminations. C'est une espèce hétérofermentaire (c'est à dire produisant de l'acide lactique et du CO2). On ne connaissait pas la structure de ce génome.
Le chromosome de Lactobacillus sakei 23K (débarrassé de ses plasmides) a été cartographié génétiquement et physiquement par une équipe de l'INRA à Jouy en Josas. AM Dudez et al.; Microbiology 148 (FEB02) 421–431.
Onze groupes de gènes déjà connus ont été localisés, ainsi que 25 nouveaux loci répartis sur le chromosome, ainsi que 11 régions flanquant les gènes ribosomiques. Les nouveaux loci ont été séquencés plus ou moins complètement, et la fonction de la moitié d'entre eux identifiée.
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96. Chez Saccharomyces cerevisiae, la suppression des réarrangements génomiques est liée aux vérifications en cours de réplication. K Myung et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (02APR02) 4500-4507. L'addition de faibles doses de méthyl méthane sulfonate active les vérifications au cours de la phase S de réplication, mais pas aux phases G1 ou G2 où le cycle est bloqué face à une erreur dans l'ADN. Il existe, en réalité chez la levure comme chez les autres organismes, deux vérifications au cours de la phase S, la vérification de la réplication et la vérification dite intra-phase S. Cette dernière donne lieu à un ralentissement de la réplication et du cycle, tandis que la première arrête carrément le cycle et inactive les origines tardives de réplication en cas d'erreur. Ces deux vérifications jouent un rôle dans la limitation des instabilités génomiques qui sont souvent des translocations ou délétions suivies de la formation de nouveaux télomères.Des mutations dans les voies RAD24 ou SGS1 de la vérification intra-S montrent une synergie dans ce domaine où intervient également RAD53. PDS1 et le complexe RAD50– MRE11–XRS2 interviennent dans les deux types de vérification.Des mutations combinées accroissent de 12 000 à 14,000 fois les réarrangements. C'est manifestement une redondance de tous ces systèmes qui permet de limiter les réarrangements.
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97. Les microorganismes que nous utilisons ne sont jamais, naturellement optimisés pour nos besoins, mais pour les leurs, et la sélection dans ce but a eu le temps de jouer. Il nous faut donc détourner les flux métaboliques en notre faveur. C'est l'objectif de l'ingéniérie métabolique qui suppose une connaissance relativement approfondie des flux métaboliques. Les goulets d'étranglement ne sont pas trop difficiles à identifier intuitivement et qualitativement, mais des étapes limitant plus subtilement les fluxs sont plus difficile à cerner, surtout dans le cas des métabolites secondaires qui ne sont pas massivement produits. Une fois les enzymes critiques identifiées, il est finalement, assez facile de corriger ce qui ne nous convient pas.
C'est ce qui a été fait pour Lactococcus lactis,chez qui des chercheurs hollandais associés à un chercheur sud-africain, ont utilisé un modèle de la distribution du pyruvate pour établir les flux menant à l'acétoïne et au diacétyl, qui constituent l'arôme des produits laitiers frais, notamment du beurre. MHN Hoefnagel et al.; Microbiology 148 (APR02) 1003–1013. Le modèle peut être consulté à http://jjj.biochem.sun.ac.za/wcfs.html. Le modèle indique que les enzymes critiques sont situées hors de la voie de l'acétolactate synthase qui donne ces produits. Le fait que l'inactivation de la lactate déshydrogénase et la surexpression de la NADH oxydase stimulent fortement cette production a été confirmé expérimentalement. Des déductions intuitives sont difficiles dans ces réseaux ramifiés de régulation. Les auteurs ont utilisé les coefficients métaboliques de la "metabolic control analysis" qui sont définis comme le pourcentage de modification d'un flux pour une modulation de 1% de l'activité d'une enzyme et qui conviennent pour de faibles modifications mais qui ont le désavantage de ne pas convenir pour des changements importants, ce qui n'est pas gênant dans ce cas.
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98. Le rendement en éthanol de la fermentation du xylose par des Saccharomyces cerevisiae recombinantes peut être amélioré en réduisant le flux oxydatif dans la voie des pentoses. M Jeppsson et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (APR02) 1604-1609.###
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99. Le défaut des champignons filamenteux est d'être filamenteux, ce qui gêne lors des cultures submergées, en donnant lieu à des entrelacs inextricables de la biomasse, biomasse qui doit être agitée d'une façon ou une autre dans la mesure où le métabolisme des Aspergillus, par exemple, est strictement aérobie, agitation qui stresse l'organisme. La production de pénicilline dans de telles conditions n'avait été possible que quand on a réussi à cultiver de petites pelotes d'hyphes. L'ennui est qu'on ne connaît pas bien les mécanismes de ce développement et qu'une ingéniérie métabolique de la morphologie est donc plus ou moins hors de portée pour l'instant, même si on sait transformer le champignon.
Des chercheurs de Novozymes (qui est un grand utilisateur de ces champignons) ont inactivé les gènes chsB (chitine synthase B) et csmA (chitin synthase with a myosin tail A) d'Aspergillus oryzae. C Müller et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (APR02) 1827-1836. L'allongement des hyphes est sensiblement ralenti dans les deux cas, mais la ramification (qui n'est pas un défaut majeur si les ramifications ne s'allongent pas trop) est fortement augmentée dans le cas des mutants de chitine synthase et diminuée de 25% dans l'autre. Point important: la production d'að-amylase (qui est pourtant une enzyme pariétale) n'est pas affecté dans les deux cas.
La transcription de chsB est pilotable dans une autre souche d'A.oryzae, grâce au promoteur niiA régulable par la source d'azote. On a ainsi pu montrer que la chitine synthase joue un rôle important dans les ramifications, mais que les changements dans la transcription ne sont suivis dans la ramification qu'après un long délai.
Les chitine synthases ont été étudiées surtout chez Aspergillus nidulans. Les colonies dont chsB a été inactivé sont désorganisées et hyper ramifiées. Quand c'est csmA qui est inactivé on retrouve moins de chitine et les parois des hyphes présentent de nombreuses anomalies. Les deux domaines de chitine synthase et de myosine sont nécessaires à une formation d'hyphes normaux.
On trouvera, par ailleurs, dans ZJ Li et al.; Biotechnology & Bioengineering 77 (20MAR02) 601-613, une analyse des paramètres physiques des hyphes gouvernant leur rupture lors de turbulences hydrodynamiques. C'est une caractéristiques qui évolue au cours d'une culture à grande échelle.
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100. Des chercheurs britanniques ont optimisé la production, par Schizosaccharomyces pombe, de nanoparticules (1,8 nm) semi-conductrices de sulfure de cadmium amorcées par un peptide (P Williams et al.; Enzyme and Microbial Technology 30 (13MAR02) 354 362). C'est la façon dont la levure neutralise le métal, et une production anecdoctique en laboratoire a déjà été décrite. Les cristallites sont gainés par de petits peptides (gð-ðGlu-Cys)n-Gly ou n est de 3-4, et sont beaucoup plus homogènes en taille et beaucoup plus stables que ceux qui sont produits par synthèse chimique. Ce sont des peptides qui sont voisins de la glutathione. Mais, pour l'instant on se heurte des problèmes de changement d'échelle dans la production. C'est ce sur quoi les auteurs se penchent.
L'effet glucose, qui consiste une répression du fonctionnement de la mitochondrie et du développement, est toujours un problème quand la productivité en biomasse au cours de la culture est directement proportionnelle à celle du produit recherché. C'est le cas ici bien qu'on ait toujours affirmé que Sch.pombe n'est pas sujette à cette répression. Tout pyruvate qui donne de l'éthanol par décarboxylation est perdu pour le cycle tricarboxylique et la croissance de la biomasse. Les auteurs ont utilisé, pour cette production, un système fed-batch évitant cette répression par le glucose de la production de biomasse et entraînant la production d'éthanol. Les auteurs ont, ainsi, optimisé la croissance même en présence de cadmium.
Un dernier (?) point reste à résoudre celui de la production accrue des peptides enrobants. Il faudra accroître la production de glutathione ou de cystéine. C'est nettement plus compliqué que de piloter la répression par le glucose.
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Les Protéines et les Enzymes
102. La revue sur les að-amylases de MJEC van der Maarel et al.; Journal of Biotechnology 94 (28MAR02) 137 155 analysée dans le Bulletin d'Avril §101, comporte une chapitre sur leur utilisation en boulangerie pour améliorer la levée du pain et éviter la rétrogradation des amidons (pain rassis), que je reprends ici. Ce sont des exo-amylases grignotant les chaînes d'amidon par le bout en égrenant des maltoses, les amyloglucosidases égrenant des glucoses.
La levée du pain est liée à la décarboxylation des sucres simples présents dans la pâte. On peut augmenter leur quantité en attaquant l'amidon par ces amylases. On peut utiliser soit du malt (grain germé et donc enrichi en ces enzymes destinées à permettre la croissance du germe en plantule à partir des réserves d'amidon de l'albumen), soit des enzymes fongiques.
Le rassisement est essentiellement une rétrogradation (en gros une recristallisation) de l'amidon. C'est une cause de pertes énormes en boulangerie. Novo-Nordisk indique des pertes d'un milliard de dollars aux Etats-Unis. On procède donc à une addition de quantité d'additifs que les boulangers ne connaissent qu'à peine, car ils sont incorporés à la farine livrée.
Ce peut être du gluten qui améliore la structure de la pâte, de la poudre de lait des émulsifiants (mono- ou diglycérides, des sucres esters, des lécithines diverses, etc…), des graisses granulées, de l'acide ascorbique ou du bromate de potassium), de la cystéine, des sucres et des sels.
Plusieurs enzymes ont été proposées dans ce cadre et on trouvera dans l'US Patent n°6 365 204 (02APR02) de Novozymes, un bon schéma des diverses enzymes utilisables pour améliorer la structure du pain. Ce sont des glucose oxydases, hémicellulases, lipases, protéases et xylanases, voire laccases. Elles n'interviennent pas sur la fraction amylacée. C'est le rôle des að-amylases, amylases maltogéniques et amyloglucosidases, enzymes ramifiantes et déramifiantes.
Les ðað-amylases fournissent donc des sucres solubles pour la fermentation par la levure, mais peuvent également jouer contre le rassissement et, de toute façon, contribuent à la souplesse du pain. Un des problèmes est qu'il faut soigneusement doser les ðað-amylases: un faible excès et on obtient un pain collant. Cet effet est lié à la production de dextrines ramifiées de 20 à 100 glucoses. Il faut donc compléter cette action avec une pullulanase thermostable (enzyme déramifiante).
Les enzymes ramifiantes sont, par contre, utilisées pour augmenter la durée à l'étalage et le volume des produits en intervenant lors de la cuisson. C'est également le cas pour les amylases maltogéniques qui donnent des chaînes linéaires de 2 à 6 glucoses.
Une telle enzyme, thermostable vu son utilisation, de Bacillus stearothermophilus est actuellement commercialisée. Elle est, certes un peu endoamylasique, mais à la température de la cuisson du pain, c'est une exo-amylase intervenant à la température où l'essentiel de l'amidon se gélatinise.
L'utilisation des cyclodextrines glycosyltransférase a été préconisée pour augmenter le volume de la pâte. Ceci serait lié à la formation progressive de ces composés cycliques au cours du pétrissage (voir le Bulletin d'Avril §105). Comment ces composés agissent est une question ouverte.
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103. Le gène d'une nouvelle endoglucanase d'Aspergillus niger vient d'être cloné par des chercheurs de Wageningen. Cette enzyme, dénommée EglC, est surtout active sur les xyloglucanes, ce qui distingue cette enzyme des EglA et EglB d'A.niger qui sont surtout actives sur les bð-glucanes. AA Hasper et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (APR02) 1556-1560.
Chez les plantes les xyloglucanes sont étroitement liés aux fibrilles de cellulose et l'enzyme possède un domaine se liant à la cellulose que ne possèdent pas EglA et EglB.
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105. Clostridium cellulovorans utilise un complexe cellulasique de type cellulosome avec une protéine-squelette, CbpA, fixant huit protéines dont cinq enzymes de la cellulolyse (endoglucanases EngE et EngK, cellobiohydrolase ExgS, xylanase XynA, mannanase ManA) plus trois protéines de fonctions inconnues. Il y a, curieusement, deux complexes distincts où les proportions de ces protéines diffèrent. K Murashima et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (APR02) 1610-1615.
Plusieurs autres enzymes celllulolytiques existent, par ailleurs, chez cette bactérie, engB, EngH, EngK, EngL, EngM, et EngY,plus ExgS , une exoglucanase. En sus de la mannanase on trouve une pectate lyase, PelA, et une xylanase XynA dont les gènes ont été clonés et séquencés.
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106. Plusieurs stratégies sont utilisables pour modifier le profil d'activité d'une enzyme en fonction du pH. La première consiste en un remplacement des groupements fonctionnels ionisables impliqués dans la reconnaissance du substrat ou l'activité catalytique. On peut également substituer les acides aminés proches des acides aminés catalytiques pour modifier des liaisons hydrogènes ou salines, ce qui peut altérer l'environnement électronique. Mais ce type de modifications donne des résultats difficilement prédictibles.
On peut, par ailleurs modifier des interactions à plus grande distance, notamment les charges de surface de la protéine. Rendre la charge de surface plus négative augmente le pKa des groupements ionisables, et donc le pH opt, par exemple. Inversement une charge plus positive abaisse le pKa. Mais cet effet dépend de la force ionique et, s'il est maximum à faible force ionique, il disparaît à une force ionique de 1M.
Un tel effet à distance a été révélé par le groupe de Fersht sur la subtilisine où des changements à des distances de 12,2 à 24,4 Å de l'His64 (qui est la base catalytique) change son pKa de 0,1 à 0,4 avec des effets additifs.
Dans la glucoamylase d'Aspergillus awamori, la Ser411 est liée, par une liaison hydrogène, avec le Glu400, qui est la base catalytique. Une mutation Ser411>Ala ou Cys augmente le pHopt sur maltose ou maltoheptaose de 0,8 à 0,9 sans modifier le Kcat, c'est à dire l'activité catalytique. Chez des xylanases, le pHopt est en corrélation étroite avec l'acide aminé adjacent à l'acide aminé catalytique. Chez les xylanases acides, c'est un asparate, chez celles qui sont plus basiques c'est une asparagine. Mais, contrairement à ce que laisseraient penser les considérations électrostatiques, la substitution de l'Asn35>Asp abaisse le pHopt de la xylanase de Bacillus circulans de 5,7 à 4,6.
La modification du pHopt d'une enzyme ne repose actuellement pas sur une base rationnelle suffisante. Or il est crucial de pouvoir le faire dans la mesure où une enzyme doit pouvoir fonctionner, soit au même pH que les enzymes utilisées, par ailleurs, dans un procédé (voir la transformation des amidons, par exemple), soit à un pH prédéfini pour un milieu donné. Les chercheurs de Novozymes et de Roche Vitamins (A Tomschy et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (APR02) 1907-1913) se sont attaqué au cas des phytases, dont je rappelle qu'elles sont utilisées pour mobiliser et rendre plus digestibles les phosphates de l'acide phytique des végétaux (myo-inositol hexakisphosphate). Ils se sont attaqués à la phytase d'Aspergillus fumigatus et à ce que l'on appelle les phytases consensus. Ils ont fait décroître la charge négative de surface d'une enzyme mutante (Gln27>Leu) en glycinamidylant les aspartates et glutamates de surface, ce qui abaissent le pHopt de 0,5 mais inactive, malheureusement, l'activité de 70 à 75%. Une étude de la structure tridimensionnelle de la phytase et de la phosphatase acide d'Aspergillus niger ainsi que de la phytase de Peniophora lycii a permis de déduire que les substitutions des Gly277 et Tyr282 par les acides aminés correspondants de la phytase d'A.niger (Lys et His) permet un second pHopt entre 2,8 et 3,4. De plus la mutation ponctuelle Lys68Ala ainsi que la double mutation Sér140>Tyr-Asp141>Gly abaissent le pHopt pour les phytates de 0,5 à 1,0 unité, sans modification notable de l'activité.
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107. On trouvera dans CM Joost et al.; Enzyme and Microbial Technology 30 (13MAR02) 295–304, une revue sur les cyclodextrines glycosyltransférases (CGTase).
Ce sont des að-amylases bactériennes avec une spécificité de produit particulière. qui convertissent l'amidon en oligosaccharides de 6, 7 et 8 glucoses (að-, bð- et gð-cyclodextrines). La bactérie s'en sert probablement pour rendre le substrat inaccessible aux autres. On s'en sert pour produire industriellement ces cyclodextrines qui ont de multiples usages liés au fait que l'anneau possède une cavité hydrophobe dans laquelle on peut insérer toutes sortes de molécules d'une taille correspondante. Ces produits restent malheureusement très coûteux. On s'en sert également pour construire des oligosaccharides modifiés comme le stevioside (un diterpène glycoside couplant un sucre au stéviol de Stevia rebaudiana). Enfin moyennant certaines substitutions on peut en faire des að-amylases non cyclisantes. Le stévioside est en réalité un mélange amer et peu soluble après extraction des feuilles de cette plante sud-américaine. La CGTase permet une glycosylation qui réduit ces deux défauts. Les CGTases présentent encore beaucoup de défauts dans la mesure où leur spectre de produit est étroit, et où les proportions des trois produits possibles sont difficilement pilotables. Enfin l'activité de ces enzymes est inhibée par le produit.
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108. Des chercheurs de Puerto Rico montrent que la co-lyophylisation de la subtilisine Carlsberg avec de la méthyl-bð-cyclodextrine permet une forte activation de l'enzyme en milieu organique, en tout cas plus forte que celle de l'enzyme sous forme de cristaux pontés par du glutaraldéhyde, cequi est une technique classique de stabilisation. I Montanez-Clemente et al.; Biotechnology & Bioengineering 78 (05APR02) 53-59.
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109. Seuls les champignons dits des pourritures blanches comme Phanerochaete chrysosporium sont capables de minéraliser complètement la lignine (lentement mais sûrement). Ce champignon sécrète deux peroxydases à hème, la lignine peroxydase (LiP) et la manganèse peroxydase. Un certain nombre de gènes ou cDNAs de LiP ont été séquencés et ont permis de déterminer les résidus catalytiques assurant une fonction peroxydase : une His distale et une proximale, une Arg distale et un Asp maintenu par une liaison hydrogène avec l'His proximale. Tous sont conservés.
Je rappelle que ce type d'enzymes catalyse une oxydation à un électron de composés aromatiques non phénoliques, avec un très fort potentiel redox. LiP peut interagir et oxyder des substrats polymériques comme la lignine et le cytochrome c ferreux (Cc2+) grâce à un transfert d'électrons à grande distance. L'oxydation du cytochorme c ferrique (Cc3+) nécessite un co-facteur, l'alcool vératrylique. On trouve beaucoup de rôles à cet alcool, ce qui signifie probablement qu'aucun n'est le bon. Deux sites de fixation ont été déterminés par mutagenèse dirigée. L'un est situé au niveau du Glu146 de la poche hème distale. L'autre est le Trp171 à la surface de la protéine, et qui est hydroxylé durant la catalyse.
Il n'est pas impossible que d'autres sites puissent exister, notamment un correspondant au retour à l'état natif. T Johjima et al.; Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 17 (25APR02) 49–57.
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110. On trouvera dans M Hofrichter; Enzyme and Microbial Technology 30 (16APR02) 454–466, une revue sur les peroxydases à manganèse et la délignification. Ces enzymes oxydent les ions Mn2+ omniprésents dans tous les bois et sols en Mn3+ hautement réactifs qui font le travail. Ces ions réactifs sont stabilisés par des chélatants comme l'acide oxalique.
La dépolymérisation est stimulée par des co-oxydants comme des thiols (i.e. la glutathione) ou des acides gras insaturés et leurs dérivés (i.e. le Tween 80).
La peroxydase à Mn est une glycoprotéine à hème découverte chez Phanerochaete chrysoporium, mais a été un peu délaissée en faveur des lignines peroxidases (LiP). Le fait que la LIP n'est pas présente chez tous les champignons ligninolytiques a réouvert le dossier.
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111. Des chercheurs espagnols et argentins ont caractérisé deux laccases de Coriolopsis rigida (un champignon de la catégorie des pourritures blanches). C'est le seul type d'enzymes ligninolytiques de ce champignon, qui dégrade pourtant la paille de blé (en sus du pétrole brut). Cette enzyme lui permet de produire des radicaux libres oxygène, ce qui lui permet de dégrader non seulement la lignine, mais toute une série de xénobiotiques aromatiques et aliphatiques. MCN Saparrat et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (APR02) 1534-1540.
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L'Agroalimentaire
112. Une arginine aminopeptidase de Lactobacillus sakei qui hydrolyse exc;lusivement les acides aminés basiques à l'extrémité N-terminale des peptides vient d'être caractérisée. L'efficacité est maximale sur un dipeptide où l'acide aminé en C-terminal est Arg, Lys ou Ala.
Ce type de peptidases contribue à l'arôme de produits carnés fermentés (charcuterie). Lactobacillus sakei est en effet utilisé dans la fabrication des saucissons, volontairement ajouté ou naturellement présent. On connaît ce que l'on appelle les aminopeptidases dites générales (PepC et PepN) cytoplasmiques des lactocoques et lactobacilles des produits lactés. Ces enzymes ont une spécificité très large (d'où leur nom). L.sakei a absolument besoin d'arginine, peu abondante dans la viande sans hydrolyse préalable des protéines, importation des peptides résultant, puis hydrolyse intracellulaire des peptides importés.C'est l'intérêt pour la bactérie de cette aminopeptidase particulière. Y Sanz et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (APR02) 1980-1987.
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113. La fourniture des acides aminés essentiels est un poste de dépenses pour l'alimentation animale qui n'est pas négligeable. Cela entraîne l'addition de compléments nutritionnels qui peuvent être coûteux. D'où la recherche de productions végétales les plus équilibrées possibles, éventuellement transgéniques.
Trois approches sont possibles pour améliorer la qualité des protéines. La première a été d'exprimer le gène codant une protéine déjà connue comme très équilibrée en acides aminés essentiels dans une plante cultivée, déjà bien maîtrisée sur le plan agronomique. Une autre est de prendre une protéine déséquilibrée provenant d'une plante cultivée, de modifier sa séquence et sa composition, et de la faire accepter par sa plante de production. Le résultat est, en général, peu satisfaisant, car on désorganise la protéine. Une troisième approche consiste à créer délibérément une protéine synthétique équilibrée dans sa composition et sensée être stable. On a essayé de faire produire de telles protéines par des bactéries pour des raisons de simplicité à l'époque de la conception de ces idées. On n'a jamais obtennu des quanités suffisantes, probablement pour des raisons de stabilité. ;
Un groupe canadien s'est inspiré des principes de repliement de protéines naturelles et a essayé de coder ces acides aminés dans des protéines synthétiques. Une að-hélice peut accommoder les principaux acides aminés essentiels. Ils ont donc construit une protéine de ce type qu'ils appelle Milk Bundle-1 (MB-1) avec un certain nombre prérequis sur la position des acides aminés pour entraîner un "hydrophobic collapse" facilitant la formation de l'hélice (si j'ai bien compris) qui consiste à obliger thermodynamiquement les parties hydrophobes à se placer à l'intérieur de l'hélice. Les boucles inévitables pour relier les hélices, sont alors peu importantes. Malgré une amélioration notable sur le plan de la stabilité, les premières constructions avaient des défauts; C'était, par exemple, la température de fusion qui était trop basse avec 39° et la résistance aux protéases qui était insuffisante. Ce n'était donc pas une protéine assez stable pour survivre au passage dans le rumen.
Une des causes de l'instabilité était la tyrosine 62 malencontreusement placée, enfouie dans la partie hydrophobe mais dont le groupement hydroxyle est une source de déstabilisation. Elle a été remplacée par un tryptophane qui est un acide aminé moins polaire. Une stabilisation supplémentaire a été, classiquement, la construction d'un pont disulfure. M Williams et al.; Journal of Biotechnology 94 (11APR02) 245-254. Les auteurs ne mentionnent pas les inévitables vérifications d’antigénicité finales.
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113. J'ai trouvé dans un article passionnant relativement ancien (JA Depree et al.; Trends in Food Science & Technology 12(MAY-JUN01) 157–163) écrit par un fabricant néo-zélandais, sur ce que l'on sait (c'est à dire pas beaucoup, mais quand-même…) de la structure et de la stabilité de la mayonnaise, sur la contribution des différents constituants à la formation et à l'oxydation des lipides, sur les techniques utilisées de stabilisation. Il y a notamment une analyse des interactions entre lumière (des éclairages de supermarchés et fer sur l'oxydation et des effets, souvent paradoxaux des antioxydants, sur la formation des flaveurs dans la bouche et leur développement au cours de la consommation de l'émulsion .
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116. Une bonne conservation des filets de poissons congelés passe par l'addition de substances protectrices. Des chercheurs britananiques ont étudié l'effet d'antioxydants (vitamines C et E 250 ou 500 mg/kg), avec ou sans citrate, des cryoprotectants (saccharose 4% ou sorbitol). L'effet a été suivi sur 210 jours, des filet de morue à –30° servant de témoin. Les auteurs préconisent l'utilisation conjointe des antioxydants et de cryoprotectants pour éviter le caractère fibreux à la décongélation et des flaveurs désagréables dues à l'oxydation des lipides. F Baddi et al.; Journal of Agricultural & Food Chemistry 50 (27MAR02) 2053-2061.
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Les Probiotiques
117 La survie de divers Bifidobacterium infantis et B.longum après spray-drying, est analysée dans WC Lian et al.; International Journal of Food Microbiology 74 (25MAR02) 79-86. C'est une technique d'évaporation rapide dans un courant d'air chaud d'une suspension pulvérisée qui est celle du lait en poudre. En général les bactéries sont adsorbées sur un "carrier". La nature de ce support est importante pour la survie. Cela dépend également et normalement de la souche et de la température de l'air utilisés, la souche B6 de B.longum étant la plus résistante avec du lait écrémé comme support et à 50°.
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118. L'acide ascorbique a bien d'autres fonctions qu'antioxydantes. Une revue sur sa synthèse, sa régénération, sa dégradation, ainsi qu'un rôle mystérieux dans l'expression génique est parue avec O Arrigoni et al.; Biochimica et Biophysica Acta General Subjects 1569 (15JAN02) 1-9.
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119. Les proanthocyanidines du grain de raisin sont du type procyanidines polymérisées, plus quelques flavanols monomériques. Les vertus du vin rouge leur sont attribuées ("French paradox"). Anthocyanes et flavonols sont absents.Les proanthocyanidines des grains de raisin, sont commercialisées dans plusieurs pays comme suppléments nutritionnels "naturels". On n'en a, cependant, apparemment fait que très peu d'analyses toxicologiques et certaines dont on est sûr qu'elles ont été entreprises n'ont pas été publiées. Des chercheurs de Kikkoman ont repris ces études et publient leurs résultats. J Yamakoshi et al.; Food and Chemical Toxicology 40 (MAY02) 599–607. Leurs résultats sont favorables à une utilisation.
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La sécurité alimentaire
120. La possibilité de la production d'acrylamide, dont on sait qu'elle est cancérigène, annoncée par des organismes suédois dans des aliments riches en carbohydrates comme les céréales et leurs dérivés, ainsi que la pomme de terre, quand ils sont frits a semé une panique chez les industries alimentaire productrices de chips et autres produits. Le comité scientifique de l'American Association of Cereal Chemists s'est immédiatement saisi de ce problème. Pour l'instant la nouvelle est connue par la presse générale, et aucune publication scientifique n'est encore venue étayer l'affirmation. PRNewswire (25APR02).
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122. Les aliments infantiles à base de lait de soja ne constituent pas une source de phytoœstrogènes suffisamment importante pour créer des problèmes de type anti-œstrogènes, malgré le fait que le lait de soja ait une faible activité œstrogénique. VJ Pocock et al.; Food and Chemical Toxicology 40 (MAY02) 643–651.
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123. On propose d'utiliser une laccase dans la stabilisation et la clarification des jus de fruits. Novozymes publie les résultats des essais de toxicité de la laccase de Polyporus pinsitus exprimée dans Aspergillus oryzae. Il n'y a pas de toxicité détectable dans les essais classiques (sinon ils ne seraient vraisemblablement pas publiés) et l'affaire s'arrêterait là. DS Brinch et al.; Food Additives & Contamination 19 (APR02) 323-334.
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124. Dans le cadre d'une réévaluation toxicologique des plus de 1700 substances aromatisantes autorisées en 1965, que l'Expert Panel of the Flavor and Extract Manufacturers Association (FEMA auquel contribuent des chercheurs du TNO hollandais) a lancé en 1993, les résultats concernant les pyrazines sont publiés dans TB Adams et al.; Food and Chemical Toxicology 40 (APR02) 429–451.
Des 41 pyrazines de la liste, une seule n'est pas substituée. Les autres sont substituées par un ou plusieurs groupements alkyl, alicyclique, acétyl, alkoxy et/ou alkyl thiol/sulfures. Les formules de tous ces composés figurent dans la revue.
Les pyrazines interviennent dans la flaveur de nombreux produits grillés, rôtis ou traités à des températures équivalentes. On pense que leur origine est dans une condensation d'aminoacides et de sucres selon le schéma de Strecker. On en trouve usuellement de 0,001 à 40 ppm dans les produits de ce type selon le TNO.
Parmi ces pyrazines les deux tiers des quantités commercialisées concernent dans l'ordre décroissant de taille du marché, l'acétylpyrazine, la 2,3,5-triméthylpyrazine et la 2,3,5,6-tétraméthylpyrazine).
La 2-méthoxy-3-isopropylpyrazine donne une odeur de pois frais, la 2-acétylpyrazine donne l'odeur de popcorn, diméthyl et triméthylpyrazines, dont des seuils de détection olfactives s'étalent, selon les composés sur 8 ordres de grandeur. Ceci entraîne des seuils de tolérance différents, mais aucune des substances ne présente de risques aux quantités utilisées et, de plus, les quantités autorisées en addition sont parfois très inférieures à celles présentes dans des produits cuisinés par les particuliers.
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125. L'absence de génotoxicité des flavones polyméthoxylées des écorces d'agrumes est décrite dans un article de chercheurs de Cargill. B Delaney et al.; Food and Chemical Toxicology 40 (MAY02) 617–624.
Cette vérification est intéressante dans la mesure où ces composés peuvent être génotoxiques (quercetine et rutine, les versions glycone de la quercetine) ou, au contraire inhiber la génotoxicité de toxines comme l'aflatoxine B1. Les deux effets présentent, par ailleurs, des mécanismes très différents dans les deux catégories. Ceci fait que prévoir l'effet de mélanges est difficilement prévisible. Les essais de Cargill ont utilisé les composés dans les proportions de production.
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126. Un article de chercheurs de Santiago de Compostela insiste sur la nécessité de mieux contrôler la présence des virus de l'hépatite A et des entérovirus dans les mollusques comestibles européens. Ils soulignent la très grande fréquence de ces virus dans les moules de Galice qui est l'un des plus gros producteurs de moules du monde. Ils ont également recherché les Escherichia coli. On admet généralement que la présence d'E.coli est un signe de contaminations fæcales, et donc entraîne une suspicion de contaminations virales comme le poliovirus. La production de la région est considérée comme modérément polluée, selon les normes européennes, et les meilleures moules sont celles récoltées face aux égouts de Vigo, où elles engraissent le plus facilement. Une sérieuse épuration est donc nécessaire avant la commercialisation. Les moules cultivées sur radeaux sont nettement plus propres, avec 44% des échantillons contenant moins de 230 Escherichia par moule, contre 23 % pour les moules sauvages et 11% pour les coques. Il n'y a cependant pas de corrélation entre les contaminations bactériennes et virales. Ce qui fait que l'absence de coliformes ne signifie pas celle des virus, comme on l'admet actuellement. La détection des virus nécessite la RT-PCR, mais elle n'est réellement efficace que pour l'hépatite A. Les auteurs soulignent donc que la détection moléculaire est possible mais qu'il faut, au préalable, standardiser les méthodes de décèlement (mot effectivement français) de ces virus. JL Romalde et al.; International Journal of Food Microbiology 74 (25MAR02) 119-130.
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127. Les souches deVibrio cholerae, agent du choléra, comporte deux groupes : les souches dites O1 et les autres. Toutes les grandes pandémies de choléra depuis 1881 ont été causées par le sérotype O1. Les souches non-01 comprennent plus de 130 sérotypes différents et ne sont isolées qu'à partir de cas plus ou moins isolés de choléra. Le groupe 01 comprend deux biotypes, le biotype dit "classique" et le biotype El Tor. Une épidémie à Madras en 1992 a révélé l'apparition massive d'une nouvelle souche (Bengal ou O139) qui a localement supplanté la souche O1. On surveille donc cette dernière lors des importations de produits alimentaires.
C'est, en fait, une souche O1 dont l'antigène O est modifié à la suite d'une insertion dans un biotype El Tor de deux nouveaux gènes (otnA et otnB). Ce groupe de gènes est associé à une séquence d'insertion chez la souche O139.
Tous les produits aquatiques arrivant de zones tropicales ou subtropicales sont analysés, en routine, pour la présence des Vibrio cholerae. Ce contrôle donne lieu à des erreurs d'identification. L'utilisation des sérums anti O139 sur des crevettes surgelées crues a donné un résultat positif au Danemark, mais pas avec les antisérums O1, Inaba, ou Ogawa.
On a donc vérifié la toxinogénicité de la souche. Elle ne possédait pas les gènes ctx, tcpA et zot, normalement présents chez V.cholerae O1 et O139. La souche est, par ailleurs, très sensible aux antibiotiques sulfonamides, trimethoprim et streptomycine, car elle ne possède pas l'élément mobile SXT, un élément chromosomique mobile présent chez les souches O139. La souche contient, par contre, deux plasmides absents des autres souches O139. On a raffiné son identification, et on a constaté que des antisérums O155 sont actifs contre la souche. Les fabricants de ces kits microbiologiques devraient améliorer leurs compositions pour éviter de déceler des antigènes 139 fâcheux, quand ce sont des O22 ou O155. A Dalsgaard et al.; Journal of Food Protection 65 (APR02) 670-672.
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128. Les pathogènes Mycobacterium paratuberculosis et Listeria monocytogenes, bien que ne formant pas de spores, peuvent survive à la pasteurisation. La pasteurisation de M.paratuberculosis à plus haute température pendant un temps plus court ne donne pas de bons résultats quand la dose de départ est supérieure à un certain seuil. Il pourrait en être de même pour L.monocytogenes et Escherichia coli O157:H7. Il existe également des contaminations non pathogènes, mais dénaturant le produit, et de ce point de vue les psychrophiles sont importants. C'est le cas de Pseudomonas spp. psychrophiles qui sécrètent des lipases et des protéases.
On utilise classiquement des techniques de culture pour détecter les contaminations. Ces dernières ratent les bactéries non cultivables, mais pouvant être métaboliquement actives.
On utilise donc des colorations vitales pour détecter ces formes. On peut envisager d'autres méthodes utilisant l'expression de gènes.
La viabilité des bactéries dans le lait après un traitement thermique a été évaluée avec trois indicateurs de viabilité: culture, expression de novo d'un marqueur GFP (protéine fluorescente verte) exprimée dans des Escherichia coli ou Pseudomonas putida recombinants sous la commande du promoteur lac, intégrité membranaire basée sur l'exclusion du iodure de propidium (fluoresçant en rouge orangé). Après un traitement de 30 minutes à 63,5° le taux de bactéries survivantes est nettement plus fort quand on prend l'expression de la GFP comme marqueur qu'avec les deux autres critères (une différence de 2 logs). Ces bactéries sont donc métaboliquement actives bien que non cultivables. TS Gunasekera et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (APR02) 1988-1993.
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129. Les intoxications par Bacillus cereus sont trop peu fréquentes bien que connues de puis plus de 40 ans, pour qu'on se soit donné la peine d'identifier les souches en cause. Deux épisodes récents ont permis à des chercheurs de Pisa de procéder à une identification moléculaire des souches responsables avec un ensemble de marqueurs RAPD ainsi que la production de l'hémolysine BL, phospholipase C phosphatidylcholine-spécifique, de ceréulide, ainsi que l'identification des gènes des entérotoxines NHE, T, et FM/S, de la cytotoxine K, sphingomyélinase et de la phospholipase C phosphatidylinositol-spécifique. E Ghelardi et al.; FEMS Microbiology Letters 208 (19FEB02) 129-134.
La bactérie se manifeste par plusieurs syndromes potentiels. Le syndrome émétique est strictement lié à la production de ceréulide qui est un dodecadepsipeptide thermostable. Le syndrome diarrhéique est apparemment lié à plusieurs entérotoxines, dont la plus connue est HBL, une hémolysine à trois composants, dont deux protéines lytiques (L1 et L2) avec un composant permettant sa fixation sur la cible (B). Cette toxine est hémolytique et dermonécrotique. Il existe, par ailleurs, une entérotoxine non hémolytique (NHE) avec, elle aussi, trois composants. Les autres toxines mentionnées (T et FM et la cytotoxine CytK) sont monocomposants.
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130. Un laboratoire de la FDA (Food and Drug Administration) américaine publie les résultats d'une étude sur les résistances rencontrées chez les isolats de Salmonella récoltés en 1999-2000 aux Etats-Unis dans des produits locaux ou importés. Tous sont résistants à la rifampine (5 ou 25 µg). Sur les 502 isolats analysés, 247 sont résistants à un ou plusieurs autres antibiotiques, dont 33 à au moins deux, 25 à trois antibiotiques, …8 à cinq. Aucun isolat n'est résistant à la norfloxacine, et 7 seulement au sulfamethoxazole/ trimethoprim, 6 au trimethoprim, 3 à la gentamicine et un à la ciprofloxacine. Ces résultats sont considérés comme un élément de base pour un suivi de l'évolution des résistances à l'avenir. CR Kiessling et al.; Journal of Food Protection 65 (APR02) 603-608.
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131. La transmission d'Escherichia coli O157:H7 par les laitues irriguées est démontrée par des chercheurs de Rutgers. La bactérie est décelable une vingtaine de jours après irrigation par des eaux contaminées. L'immersion des plants une minute dans de l'eau de javel à 20ppm est insuffisante pour une décontamination. EB Solomon et al.; Journal of Food Protection 65 (APR02) 673-676.
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132. On vient de montrer que Salmonella enterica Serovar Typhimurium est capable d'échanger des ADNs par conjugaison au sein des cellules épithéliales qu'elle envahit. Ce qui n'est pas sans conséquences sur la transmission des résistances aux antibiotiques. GC Ferguson et al.; Journal of Bacteriology 184,n°8 (APR02) 2235-2242. Ces résistances sont, en effet, très souvent portées par des éléments mobiles et on pouvait se poser la question de savoir pourquoi elles ne sont pas plutôt portées par les chromosomes de souches bactériennes dominantes dans un tel environnement. Ces transferts intracellulaires mettent à l'abri des antibiotiques les bactéries sensibles, mais elles ne peuvent "sortir". Ce type de conjugaison, avec une bactérie résistante, le leur permet.
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133. L'utilisation des huiles dites essentielles comme bactéricides ou bactériostatiques est à la mode. Les effets du dill ou huile d'aneth (Anethum graveolens), du coriandre (des graines de Coriandrum sativum), du cilantro (des jeunes feuilles du même C.sativum) et de l'huile d'eucalyptus (Eucalyptus dives) ont été analysés. L'effet des huiles brutes et de leurs fractions a été mesuré sur des bactéries Gram+, Gram- et sur Saccharomyces cerevisiae. L'huile de cilantro est particulièrement efficace sur Listeria monocytogenes, probablement du fait de la présence d'alcools et aldéhydes à longues chaînes (C6-C10). L'effet des fractions est souvent supérieur à celui de l'huile brute, ce qui indique, dans certaines de ces huiles, des effets antagonistes à déterminer. PJ Delaquis et al.; International Journal of Food Microbiology 74 (25MAR02) 101-119.`
Des chercheurs sud-africains ont étudié les effets de ces huiles sur des champignons produisant des mycotoxines comme Aspergillus parasiticus et Fusarium moniliforme Dans ce cas c'est l'huile de clou de girofle (eugénol) qui est la plus efficace, suivie par celle de cannelle (aldéhyde cinnamique), puis de l'origan (carvol et thymol) et enfin du macis (écorce de la noix de muscade, myristine). Neem et essence d'eucalyptus n'ont aucun effet. S Juglal et al.; Journal of Food Protection 65 (APR02) 683-687. Ce sont des méthodes à la portée des paysans des pays où ces plantes aromatiques poussent.
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134. Le groupement hydroxyle du carvacrol que l'on trouve dans les extraits huileux de thym (45% de carvacrol) et d'origan (60 à 70%) est indispensable à son action bactéricide sur Bacillus cereus. (Voir le Bulletin de Mars §141). Il déstabilise la membrane et agit en échangeur de protons, réduisant ainsi le gradient de protons. C'est pourquoi il entraîne une mort cellulaire au dessus de 1mM. A Ultee et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (APR02) 1561-1568.
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L'Environnement
137. La réduction des sulfates est une caractéristique très fréquente dans les communautés microbiennes anoxiques, où cette respiration permet de pallier l'absence d'oxygène. Cette réduction est assurée par des microorganismes divers. Ils peuvent utiliser plusieurs substrats carbonés dont les hydrocarbures sous leurs diverses formes, jusqu'aux formes halogénées. Ces populations permettent de rendre compte de 70% de la dépollution en moyenne. Durant la dégradation des hydrocarbures des intermédiaires de faibles masses moléculaires comme les acides acétique, propionique et butyrique sont produits dans les sédiments marins. Dans les aquifères on n'en sait trop rien. Ce qui est connu est que les espèces ont des préférences vis-à-vis de ces acides, mais le lactate est un des plus acceptés.
On trouvera dans J Kleikemper et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (APR02) 1516-1523, une étude des bactéries réductrices des sulfates dans un aquifère contaminé par des hydrocarbures. Ils ont utilisé la technique de push-pull qui consiste à injecter dans l'aquifère un substrat comprenant les acides organiques et des sulfates. Après une période d'incubation on pompe l'eau contaminée et l'on suit l'évolution par rapport au stade initial, le tout sur 72 heures. La flore et son évolution sont suivies par des marqueurs moléculaires. Elle ne change, en réalité pas beaucoup. La nature microbienne des transformations observées a été confirmée par des analyses isotopiques.
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138. Dans le but d'améliorer la détoxication des gaz de combat organo-phosphorés, des chercheurs de Riverside ont créé des Escherichia coli recombinantes exprimant à leur surface une organophosphate hydrolase (OPH) pour décontaminer et un domaine liant la cellulose, permettant l'immobilisation sur un support cellulosique comme un papier ou de la gaze. AA Wang et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (APR02) 1684-1689. Ceci est une amélioration du procédé décrit par le même groupe dans RD Richins et al.; Biotechnology & Bioengineering 69 (20SEP00) 591-596. Des gènes opd codant des OPHs ont été trouvés chez deux bactéries du sol, Pseudomonas diminuta MG et un Flavobacterium.
L'efficacité des organophosphate hydrolases varie grandement selon le composé. Elles sont très efficaces sur le paraoxon, bien moins sur le méthylparathion (tous deux des pesticides) et 1000 fois plus faibles sur l'agent VX. L'accès au site actif varie, en effet, beaucoup au delà des problèmes de perméabilité qui justifient l'exhibition de l'enzyme à la surface d'E.coli. Une approche par mutation dirigée a déjà été utilisée (voir S Gopal et al.; Biochemical, Biophysical Research Communications 279 (20DEC00) 516-519) et une augmentation de 33% a été obtenue ainsi sur VX. Mais bien que la structure tridimensionnelle de l'enzyme soit maintenant connue, il reste beaucoup à faire pour déterminer les substitutions à effectuer. Des cycles successifs d'échanges de segments d'ADN (DNA shuffling) et de criblage ont donc été, cette fois, utilisés par le groupe de Riverside, pour améliorer l'efficacité de l'enzyme sur d'autres pesticides comme diazinon et chlorpyrifos, mais surtout sur sarin et soman. CMH Cho et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (APR02) 2026-2030.
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139. La régulation de la dégradation du lindane (gð-hexachlorocyclohexane, un insecticide un peu décrié) par un Sphingomonas paucimobilis a été étudiée par des chercheurs japonais. K Miyauchi et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (APR02) 1803–1807.
Les activités LinD et LinE qui sont responsables de cette dégradation sont induites en présence de leurs substrats respectifs, 2,5-dichlorohydroquinone (2,5-DCHQ) et chlorohydroquinone (CHQ). La région amont de linE a été déterminée et l'on y trouve une ORF divergente avec linE. Le produit de cette ORF ressemble beaucoup à celle d'un régulateur transcriptionnel de type LysR, et cette ORF a donc été dénommée linR. La séquence reconnue par ce type de régulateur existe en amont de linE. Des résultats de l'inactivation, ou de marquage de linE par lacZ indiquent que LinR intervient dans la régulation de linD et linE sous l'action de leurs inducteurs normaux.
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140. Des chercheurs allemands et palestiniens ont étudié un tapis microbien benthique (cyanobactéries) très fortement pollué de la zone de Gaza (le Wadi Gaza qui est l'exutoire de toutes les pollutions industrielles, urbaines et agricoles de la zone). RMM Abeid et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (APR02) 1674-1683.
Les Phormidium et Oscillatoria sont dominantes dans ce tapis. La présence de cyanobactéries est souvent associée à la capacité à dégrader les hydrocarbures comme on le constate dans le golfe persique autour des sites d'extraction pétrolière contaminés par des fuites. D'autres bactéries y sont également présentes (groupe Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides des gð et ß Protéobactéries). Ces bactéries attaquent efficacement et complètement phénanthrène et dibenzothiophène en une semaine en laboratoire. La teneur en n-octadecane et l'hydrocarbure classique de référence pristane (2,6,10,14 tétraméthylpentadécane) sont abaissées mais ne tombent pas à zéro durant la même période et ils persistent au delà de 40 jours. .
L'exposition aux hydrocarbures enrichit la flore des cyanophycées en Halomicronema. Les bactéries qui prolifèrent durant cette exposition sont des Holophaga-Geothrix-Acidobacterium.
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141. La totale insolubilité de l'oxyde ferrique pose des problèmes aux quelques bactéries qui l'utilisent comme accepteur d'électrons quand elles respirent. Les Shewanella ont résolu le problème en sécrétant des quinones solubles qui transportent les électrons jusqu'à l'oxyde ferrique, même distant de la cellule.
On vient de montrer que Geobacter metallireducens, a choisi une autre solution. Il devient mobile quand il pousse sur l'oxyde ferrique ou de l'oxyde MnIV, avec des flagelles et des pili. Il devient chimiotactique quand il "sent" que la poubelle à électrons est pleine (l'oxyde est devenu ferreux); Il va voir ailleurs s'il ne peut pas trouver une poubelle vide avec du fer ferrique à réduire. Ceci explique sa dominance dans les populations poussant sur oxydes de fer qui ont choisi d'autres solutions. SE Childers et al.; Nature 416 (18APR02) 767-769.
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143. Le comportement de bactéries du sol en fonction de la porosité du sol a été étudié en conditions de laboratoire dans des colonnes de sable perfusées avec de l'eau de nappes. RM Lehman et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (APR02) 1569-1575. Les auteurs ont étudié quelques enzymes extracellulaires et la composition des communautés libres et fixées sur le sable.
Les formes libres ont une plus grande diversité que les formes fixées, et les formes fixées une production plus abondante d'enzymes que les formes libres. Au-delà des différences notées dans l'étude qui portent sur deux enzymes seulement, le fait que les deux communautés jouent des rôles complémentaires est évident. On sait que la fixation des microorganismes affecte profondément leur physiologie par rapport à celle en liberté. Les conditions d'accès aux substrats au sens large est entièrement différente dans la mesure où le domaine auquel chaque cellule a accès est limité, et où la diffusion est perturbée par l'existence des biofilms. Ce sont des différences de ce type qui caractérisent les fermentation en milieu liquide ou solide. D'autre part les signaux échangés sont beaucoup plus permanents qu'en liberté, où ils diffusent rapidement et atteignent une population migrante, etc…Le problème est que l'issue est difficilement prédictible avec les données que nous possédons avec, circonstance aggravante, une méconnaissance de ce qui relève des adaptations physiologique et des modifications de la population.
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La Vie des Sociétés
144. Le Burrill Biotech Select Index continue à baisser (16% en Avril, contre 4% au NASDAQ). Et pourtant sept compagnies de biotechnologie sur huit ont atteint leurs objectifs.
Genentech a perdu 30% de sa valeur, Human Genome Sciences 28%, Celera 27% et Incyte Genomics 31%. Ce n'est pas trop grave pour des compagnies qui ont des réserves (et beaucoup en ont encore pour deux ou trois ans, au moins), mais cela l'est pour les lancements, les investisseurs ne prenant plus de risques dans ce domaine.
Human Genome Sciences a vu ses revenus tomber de 5,3 millions à 600 000 dollars à la suite de l'expiration d'un contrat de recherche. Pire la firme a dû arrêter ses recherches sur un médicament maison.
Par ailleurs, les grands de la pharmacie frappés par les délais dans les développements, les litiges sur les brevets, surtout dans le cas où les pipe-lines sont vides, en prennent un coup.
Quelques compagnies progressent, comme BioRad avec ses diagnostics.
Le Burrill Agbio Index est, lui, resté stable durant Avril. Fresh Del Monte Produce, a gagné 25% et Seminis, qui produit des semences maraîchères, a fortement augmenté ses revenus (500%) et son cours a gagné 114%. PRNewswire (01MAY02).
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145. Advanced Cell Technology a acquis la licence du procédé d'Immerge BioTherapeutics pour la production de porcs transgéniques pour les xénotransplantations. Immerge est une joint-venture de Novartis Pharma et BioTransplant fondée en Septembre 2000.
Depuis, la compagnie a produit des miniporcs transgéniques incapables (?) de transmettre des rétrovirus porcins et où le gène de la 1,3-galactosyltransférase (voir le Bulletin de Février §85 et Avril §86) a été inactivé. Immerge collabore également avec Infigen sur les transferts de noyaux en vue d'un clonage. PRNewswire (16APR02).
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146. Affymetrix et The Institute for Genomic Research (TIGR) annoncent un microréseau avec 24 000 sondes d'Arabidopsis thaliana commercialisé par Affymetrix. C'est trois fois plus que le GeneChip"! vendu en 2000. Entre temps, TIGR a amélioré l'annotation de ce génome avec l'aide de la NSF. Les annotations sont disponibles (dans quelles conditions ?) à http://www.affymetrix.com et http://www.tigr.org. Affymetrix Press Release (15APR02).
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147. La firme canadienne Burcon NutraScience a déposé un brevet sur dix propriétés fonctionnelles de ses protéines de soja Puratein"!. Ce sont la solubilité, la viscosité", le gonflement à l'eau et la gélation, les propriétés cohésives, adhésives et émulsifiantes, l'élasticité, la fixation des graisses et la capacité à former des films. La firme a signé un contrat avec le Fraunhofer Institüt pour améliorer ces propriétés. Canada NewsWire (09APR02).
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148. Diversa a obtenu l'US Patent n° 6 368 798 (09APR02) sur le criblage de nouvelles activités biologiques, spécialement enzymatiques, avec des sondes correspondant à cette activité. Après quoi on l'exprime, on crible et améliore. Ses revenus ont baissé au premier trimestre par rapport à ceux de l'an passé à la même époque et la firme est toujours dans le rouge, mais elle détient encore 176,5 millions de dollars en réserve. Ces résultats sont liés à une baisse des contrats de recherches. Ses dépenses ont crû fortement du fait de sa décision de lancer une recherche interne dans le domaine pharmaceutique (Recombinant Natural Products Program et Protein Therapeutics/Antibody Program. Diversa Press Release (15APR02)
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149. L'USDA a adopté les systèmes BAX"! de Qualicon (DuPont) pour son Food Safety and Inspection Service. Cette technique génétique est destinée à déceler les contaminations, plus particulièrement par Listeria monocytogenes dans les viandes de bSuf et de volaille. L'objectif est de pouvoir informer rapidement les producteurs et importateurs d'une difficulté dans leurs produits et de réduire les faux-positifs qui sont une plaie quand on ouvre le parapluie. Des essais pour vérifier la validité sur Salmonella et Escherichia coli 0157:H7 sont en cours. DuPont Press Release (30APR02).
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150. Genencor International annonce des pertes pour son bilan du premier trimestre liées au frais de restructuration. Genencor Press Release (02MAY02). La firme a intégré Enzymes Biosystems. Des collaborations dans le domaine de l'immunologie sont en fonction. Les transferts de production de Deloit à Elkhart sont en cours. Des alliances dans le domaine des soins personnels sont en discussion.
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151. Incyte Genomics et Lion Bioscience collaborent pour commercialiser la base de donnée LifeSeq"! à travers la plate-forme d'intégration SRS de Lion. Les utilisateurs actuels de la base auront la plate-forme à leur disposition et qui servira d'interface pour la consultation en ligne. Incyte Genomics Press Release (02APR02).
Les revenus de la firme sur ces données ont baissé au cours du premier trimestre (27 millions de dollars, contre 37 l'an passé pour la même période). Pour les revenus globaux, la situation n'est guère meilleure. Là aussi la tendance est à développer des produits thérapeutiques au sein de l'entreprise. Elle possède, cependant, encore 492 millions de dollars "en caisse".
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152. Maxygen a obtenu l'US Patent n°6 368 861 (09APR02) sur les techniques d'assemblage de gènes synthétiques qui couvre sa technique dénommée commercialement GeneHarvest"!. C'est un brevet assez large faisant intervenir diverses ligases et polymérases.
La firme détient 35 brevets américains, 69 dans le reste du monde, et a déposé 450 demandes de brevets un peu partout. Maxygen Press Release 09APR02).
Maxygen avait lancé en Février une filiale chargée de développer et gérer les aspects chimiques de ses activités, Codexis. Il s'agit de produits à haute valeur ajoutée, notamment chiraux, produits par des techniques catalytiques (voir le Bulletin de Mars §167). Codexis vient de signer un contrat avec Cargill Dow à propos de la production des polylactides de cette filiale commune. Maxygen Press Release (17APR02).###
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153. Myriad Genetics et DuPont annoncent une collaboration dans l'analyse génétique des caractères des plantes cultivées intéressantes pour Pioneer. Il s'agit d'un accord sur deux ans de $24 millions pour fournir à Pioneer des informations moléculaires. DuPont Press Release (03APR02).
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155. Nexia Biotechnologies a signé un accord de développement de la filature de sa soie d'araignée BioSteel"! (voir le Bulletin de Février §88) avec une compagnie de textiles médicaux, déjà impliquée dans des productions agréées dans ce domaine, mais non spécifiée (Nexia Biotechnologies Press Release (24APR02). Des développements dans des fibres pour articles sportifs sont en discussion. Je suis curieux de voir ce qui advient des applications militaires qui étaient à l'origine du développement.
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156. Une nouvelle lipase recombinante, Lipex"! est proposée par Novozymes. Elle est destinée à une utilisation à basse température (20°). L'intérêt, pour nous, est son origine. C'est en effet, le premier produit (à ma connaissance) issu de l'évolution dirigée qui soit commercialisé. Novozymes Press Release (23APR02).
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157. Selon une analyse de Frost & Sullivan, les agences de réglementation des outils de diagnostic américaines sont en train de froncer les sourcils à propos de l'utilisation des kits commercialisés. En effet, ceux-ci sont vendus avec une notice complète sur leur utilisation, imposée par la réglementation mais, une fois délivrés à l'utilisateur, ils sont appliqués par de la main d'œuvre non formée qui les utilise n'importe comment. Elle insiste surtout sur les détections microbiologiques qui constituent un marché de plus de 500 millions de dollars souvent gaspillés ou utilisés de façon incongrue (comme de couper les languettes en morceaux pour économiser). Utiliser des tests plus complexes obligerait les utilisateurs à payer des personnes plus qualifiées. PRNewswire (01MAY02).
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158. Prionics AG et PrioSense, une émanation du Hadassah University Medical Centre de Jérusalem, ont commencé à développer un test de la présence de prions in-vivo dans l'urine. PRNewswire (30APR02).
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159. Sub-Surface Waste Management a obtenu un contrat de bioremédiation avec une chaîne américaine de nettoyage à sec dans le Michigan via American BioSystems. Sub-Surface Waste Management Press Release (01MAY02).
Les revenus de cette filiale d'U.S. Microbics ont très fortement augmenté et les finances se rapprochent de l'équilibre.
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La Politique
160. Monsanto a annoncé un accord avec le Donald Danforth Plant Science Center de Robert Beachy sur l'application (sans redevances) de ses techniques brevetées au manioc. Ce centre travaille pour l'application des biotechnologies aux pays en développement et qui, avec l'IRD (ex ORSTOM), avait travaillé sur la résistance aux mosaïques. Monsanto lui doit bien ça, compte tenu de ce que Beachy a apporté aux biotechnologies à leurs débuts et à Monsanto. Monsanto Press Release (16APR02).
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161. On trouvera dans PRNewswire (23APR02) un résumé d'une étude de Datamonitor sur les relations entre grandes firmes et entreprises de biotechnologie qui est très critique pour les déséquilibres constatés dans 200 alliances avec l'industrie pharmaceutique.
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162. La décision du Japon de couper dans ses financements dans le tiers-monde; où il était très actif, va causer des problèmes majeurs notamment dans les recherches sur le riz. Le financement du CGIAR (Consultative Group on International Agricultural Research) qui n'est pas si consultatif que cela, car il oriente le financement de 16 instituts dans le monde, va diminuer de moitié. L'IRRI de Manille célèbre dans le monde pour son travail sur le riz sera le plus atteint. Cela n'est, peut être pas pour déplaire à certains intérêts commerciaux mais ce sera une perte pour tout le monde y compris pour ces derniers dans la mesure où les collections et la compétence est beaucoup plus partagée qu'on ne le pense. Pour l'instant 20% du personnel a été licencié et l'on ne touchera pas aux collections. A une moindre échelle c'est également le cas du centre sur la pomme de terre (CIP) de Lima qui va licencier également 20% de ses effectifs. D Cyranoski; Nature 416 (25APR02) 777.
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163. On voit progressivement apparaître, dans les journaux scientifiques, des notes indiquant l'absence de conflits d'intérêt de la part des auteurs (et des reviewers) en ce qui concerne les conclusions de leur article. C'est notamment le cas de Nature et Science, et dans certaines publications dans le domaine de la nutrition. C'est encore très timide, et seuls 5 articles sur 110 ont mentionné ces conflits après la mise en œuvre dans Nature et c'est 0,5% de façon plus globale dans les revues ayant adopté cette politique. En effet, plusieurs associations commencent à s'émouvoir des problèmes posés par les relations d'argent existant entre des individus, des équipes ou des institutions et des intérêts commerciaux ou réglementaires privés ou publics. Ces relations sont encouragées pour différentes raisons, mais ont des conséquences qui peuvent biaiser les conclusions des articles publiés. On pense beaucoup aux publications médicales, mais il y a également celles touchant aux conséquences écologiques de telle ou telle initiative, et aux problèmes de sécurité alimentaire, par exemple. Deux colloques ont eu lieu récemment sur le sujet à Emory University et à Varsovie. Cette politique est ,pour l'instant, peu suivie même dans les revues strictes sur ce point de vue.
Le problème des reviewers est complexe. Transmettre aux reviewers l'existence d'un conflit d'intérêt accentue, évidemment, les doutes et renforce la nécessité d'une étude critique, mais fait jouer au reviewer un rôle éthique qui n'est pas le sien. C'est pourquoi Science et Nature ne transmettent pas ce renseignement. D'autres le font. Le New England Journal of Medicine qui, avec Lancet, est le Graal des publications médicales, fait de gros efforts sur ce point, et quand une anomalie de jugement par un reviewer fait surface, se lance dans une enquête élargie sur l'objectivité du jugement. C'est le travail de 7 personnes à la rédaction.
Il ne sera pas facile de mettre de l'ordre dans ce domaine, dans la mesure où un auteur (et éventuellement son soutien industriel) tient à publier, et la multiplicité des journaux lui laissera l'opportunité dans une revue plus laxiste de ce point de vue. Ainsi, New England Journal of Medicine signalait en février 2000 que sur 40 articles sur les effets de thérapies, 19 auraient dû signaler des intérêts commerciaux en jeu, et ne l'ont pas fait. La plupart des scientifiques pensent qu'ils ne sont pas influencés par ces liens, mais il existe un continuum au sein duquel des biais très réels peuvent apparaître. Ce sera au lecteur de surveiller ce point, ce que j'essaie de faire, mais ce n'est pas très évident.
Les revues générales, comportant normalement un second jugement (après celui de l'article original) sur de nombreux articles, posent également des problèmes de même nature, mais aggravés. Le New England Journal of Medicine impose aux auteurs de revues de ne pas avoir eu depuis deux ans de relations commerciales avec les compagnies impliquées dans le sujet traité, et ceci depuis 1990. Le problème est que, de plus en plus de scientifiques, ont de tels liens et il va devenir difficile de trouver des rédacteurs. Aussi la revue est en train de repenser sa politique.
Le problème s'aggrave avec les éditeurs de revue et certaines revues exigent que leur éditeurs ne soient pas possesseurs d'actions dans des compagnies pharmaceutiques. L'éditeur actuel de New England Journal of Medicine a dû rompre ses liens financiers avec 20 compagnies avant de prendre la tête du journal. Chez Nature on doit révéler ses liens, mais c'est à la direction de décider ce qu'il convient de faire. F van Kolfschooten; Nature 416 (28MAR02) 360-363.
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164. Selon une analyse de Frost & Sullivan, les agences américaines de réglementation des outils de diagnostic sont en train de froncer les sourcils à propos de l'utilisation des kits commercialisés simplifiés. En effet, ceux-ci sont vendus avec une notice complète sur leur utilisation, imposée par la réglementation mais, une fois délivrés à l'utilisateur, ils sont appliqués par de la main d'œuvre non formée, qui les utilise n'importe comment et cecipour des raisons d'économie. Elle insiste surtout sur les détections microbiologiques qui constituent un marché de plus de 500 millions de dollars, souvent gaspillés ou utilisés de façon incongrue (comme de couper les languettes en morceaux pour économiser). Utiliser des tests plus complexes obligerait les utilisateurs à payer des personnes plus qualifiées. PRNewswire (01MAY02).
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Bulletin des BioTechnologies – Mai 2002

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