TD Formation continue CE-MS (corrigé) - Université de Strasbourg
TD E1 : Lois générales de l'électrocinétique dans l'ARQS. But du chapitre. Revoir
le vocabulaire associé aux circuits électriques. Préciser les connaissances sur ...
part of the document
Université de Strasbourg
(U D S)
Formation continu
ELECTROPHORESE CAPILLAIRE
TRAVAUX DIRIGES
I Epreuve de Notion d'échelle dans les méthodes de séparation
Master 2 Sciences Analytiques
(M. François)
(1 heure)
Remarque : Les documents de cours et la calculatrice sont autorisés lors de cette épreuve.
SEPARATION DACIDES CARBOXYLIQUES AVEC UN CAPILLAIRE EN SILICE VIERGE
On propose ici létude de la séparation électrocinétique du mélange des 8 composés suivants :
AcidesPkaférulique4,52acétylsalicylique3,48cinnamique4,44phénylacétique4,40benzoïque4,20salicylique3,11méthacrylique4,48acrylique4,28Tableau 1 : liste des acides carboxyliques
Conditions opératoires générales :
Capillaire en silice vierge, 50 mðm d.i. x 35 cm (cellule de détection à 26,5 cm)
Electrolyte support : tampon bicine 50 mM pH 8,35
Température : 20 °C
Tension appliquée : V = + 30 kV
Détection : absorbance UV à 200 nm
Echantillon : mélange des 8 acides carboxyliques chacun à 0,1 mM (en tampon bicine 50 mM).
Lordre de sortie des composés correspond à celui donné dans le tableau 1
Fig 1 : Conditions générales, injection hydrodynamique 30mbar, 3s
Fig 2 : Influence du volume injecté
Quel type de technique électrophorétique est mise en uvre lors de cette expérience ?
Calculer le champ électrique appliqué dans les conditions données (en V.cm-1).
A quelle famille (cation, neutre ou anion) appartiennent les composés étudiés ? Justifier ?
Donner la définition dune solution tampon ?
Calculer la mobilité électroosmotique µeo et les mobilités électrophorétiques µep des différents acides (Figure 1) ?
La Figure 2 montre linfluence du volume injecté sur la séparation. Expliquer brièvement la baisse de la résolution.
Sur quel paramètre pourrait-on jouer pour éviter cette baisse de résolution ? Expliquer brièvement le phénomène souhaité?
ANNEXE
Formule chimique des composés
Acide Férulique
EMBED ISISServer
Acide Acétylsalicylique
EMBED ISISServer
Acide Cinnamique
EMBED ISISServer
Acide Benzoïque
EMBED ISISServer
Acide Salicylique
EMBED ISISServer
Acide Méthacrylique
EMBED ISISServer
Acide Acrylique
EMBED ISISServer
II
SEPARATION DE CATECHOLS ET DE CATECHOLAMINES PAR ELECTROPHORESE ET CHROMATOGRAPHIE ELECTROCINETIQUE MICELLAIRE
La figure 1 montre la séparation électrocinétique capillaire dun mélange de catéchols et de catécholamines (voir formules en Annexe) en milieu tampon phosphate, à pH 7. Préciser le mécanisme de cette séparation et interpréter lordre de migration. La durée de lanalyse peut être très sensi-blement diminuée en opérant au même pH, mais en milieu borate (figure 2). Lordre de migration est alors profondément modifié. Interpréter, sachant que les ions borate donnent, avec les composés a-hydroxylés, des complexes de la forme :
-- C -- OH - C -- O OH
HBO2 + B + H+
-- C-- OH - C -- O OH
Quelle(s) explication(s) complémentaire(s) fournissent les résultats donnés figure 3 ?
Données :
Concentration micellaire critique du SDS : 8 mM
Indices de Rekker :
- CH3 : 0,702 - CH2 - : 0,530 - CH : 0,235
( al ) - NH2 : - 1,428 ( al ) - NH - : - 1,825
( al ) - OH : - 1,491 ( al ) - CO2H : - 0,954
CORRIGE TD I
Tampon Phosphate pH 7 sans SDS :
Etat de charge des composés :
L-DOPA : -CH(NH3+)-COO- donc neutre
CAT et MC neutres
NE, N, DHBA, DA
Noyau comme CAT + chaine latérale avec amine donc protonée totalement
Charge +1
Tampon avec 20 mM SDS >CMC (8 mM) donc MEKC
Séparation des neutres entre eux par interaction hydrophobes
Micelle anionique donc séparation des chargés +1 par interaction électrostatique et hydrophobe
Incidence de la charge sur lordre de sortie
tm neutre < tm chargé +1
Normal car les chargés +1 interagissent avec les micelles anioniques donc plus retenus
Pour les neutres : Interactions hydrophobes
Séparation suivant lhydrophobie croissante donc indice de Rekker
Log Poctanol/eau = "fi donc décomposer la molécule en différent morceaux
Plus le log P augmente, plus la molécule est hydrophobe.
Partie commune du catéchol log P0
L-DOPA : log P = log P0 + fCH2 + fCH + fCOOH + fNH2
= log P0 + 0,530 + 0,235 0,954 1,428
= log P0 -1,62
CAT : log P = log P0
MC : log P = log P0 + 0,702
NE : log P = log P0 2,15
E : log P = log P0 1,85
DHBA : log P = log P0 0,9
DA : log P = log P0 0,37
Ordre attendu
En résumé, priorité à la charge globale et ensuite hydrophobicité.
Tampon phosphate borate pH 7 avec SDS :
Ordre modifié et tr bien diminuée.
Changement de charge :
Composés 1 4 sont devenus neutre et composés 5 7 chargé négativement
Inversion des familles.
1 4 : Hydrophobie rentre en jeu, plus dinteraction électrostatique.
5 7 : Plus dattraction électrostatique (répulsion avec les micelles donc pas dinclusion)
1 2 3 4 : ordre dhydrophobie (Rekker) donc ordre attendu
5 7 6 : composés chargés, se séparent par différence de mobilité (taille)
Tampon borate pH 7 sans SDS :
On attend :
Absence de séparation des composés neutres 1 4
Séparation des 3 autres comme précédemment (taille)
Séparation 5 7 6 :
On a bien CAT < MC < L-DOPA par différence de taille
Rappel : Mode contre-électroosmotique donc les plus mobiles sont détectés en dernier
Séparation 1 4 :
Ils sont neutres donc ne doivent pas être séparés mais on les distingue un peu.
Complexation non total dans le borate donc amorce de séparation (4 puis 3 puis 2 puis 1).
II
SEPARATION DE PURINES SUBSTITUEES PAR ELECTROPHORESE ET CHROMATOGRAPHIE ELECTROCINETIQUE MICELLAIRE.
La figure 1 représente une séparation électrocinétique de purines substituées dans un tube capillaire en silice fondue de 1 m de longueur et 75 mm de diamètre intérieur. La tension appliquée est de 17,5 kV. L' électrolyte est constitué de Na2HPO4 10 mM, Na2B4O7 6 mM et de SDS 50 mM. L' échantillon est mis en solution dans l' électrolyte et est introduit par électromigration à l' extrémité du capillaire relié au pôle positif. La détection est effectuée par absorptiométrie UV à 280 nm, directement à travers le capillaire, à 90 cm de l' extrémité par laquelle l' échantillon est injecté.
1/. Calculer le pH de lélectrolyte (on remarquera que Na2B4O7 est un mélange d' acide borique et de borate de sodium)
2NaBO2 + B2O3 = 2HBO2 H2O
Constantes acido-basiques :
H3PO4 : pk1 = 12,4 ; pk2 = 7,2 ; pk3 = 2,1
HBO2 : pk = 9,2
2/. Dans leau, les purines étudiées ont des propriétés basiques extrêmement faibles et ne sont protonables quen milieu très acide. A l' exception de la cafféine, elles présentent en revanche, suivant les espèces, une ou deux fonctions acides, dont les constantes sont données dans le tableau I.
a/. Etablir, pour un monoacide HA de constante k, puis pour un diacide H2A de constantes k1 et k2, lexpression de la charge apparente en fonction du pH de lélectrolyte. Déterminer la charge apparente au pH de lélectrolyte pour chaque purine.
b/. Interpréter lordre de migration et indiquer le mécanisme de séparation dominant. En quel rang sortirait la caféine en absence de SDS ? Comment peut-on expliquer le comportement du couple acide urique-xanthine ?
PurinesIdentification
(Figure 1)pK1pK2Masse MolaireThéobromineA10-180HypoxanthineB128,9136ThéophylineC8,6-180CafféineD--194Acide uriqueE10,55,5168XanthineF117,5152
CORRIGE TD II
1.
Calcul du pH de lélectrolyte :
On sait que : 2NaBO2 + B2O3 = 2HBO2 H2O
Mélange acido-basique donc leffet tampon vient du Na2H2B207
pH = pKa = 9,21
2.a.
On néglige la protonation des purines dans leau.
Donc deux cas, couple HA/A-, et H2A/HA-/A2-, et cafféine neutre.
Monoacide :
n (charge apparente) = [A-]/([A-]+[HA]) = 1/(1+[HA]/[A-]) = 1/(1+[H+]/k1)
avec k1 = [H+][A-]/[HA]
on peut déterminer n = f(pH)
Diacide :
n = ([HA-]+2[A2-]/([A2-]+[HA-]+[H2A])
comprise entre 0 et 2 car peut être dichargé.
avec k1 = [H+][A2-]/[HA-]
avec k2 = [H+][AH-]/[H2A]
avec k1k2 = [H+]2[A2-]/[H2A]
Donc en multipliant par le rapport [H+]2/[H2A], on obtient :
n = (k2[H+]+2k1k2)/([H+]2+k2[H+]+k1k2)
A : n = 0,14
B : n = 0,67
C : n = 0,8
D : n = 0
E : n = 1,05
F : n = 1,00
2.b.
Ordre de migration :
Les micelles sont anioniques donc chargées négativement
Les composés sont chargés négativement aussi
Donc les micelles ne peuvent pas apporter grand-chose à la séparation.
Séparation électrophorétique suivant la différence de charge et de taille des molécules.
Les masses sont très proches (136 à 180) donc à priori la charge a plus dimportance que la masse.
Pour les composés A, B et C :
A pH 9,2, le composé C est le plus chargé et le composé A le moins chargé (car pk = 8,6)
Donc comme on est en mode contre électroosmotique, les anions sortent du moins mobile au plus mobile
Donc A B C
Composé D :
Neutre donc sort normalement en premier avec le flux EOF, mais il peut être solubilisé dans les micelles et donc sortir avec un temps de rétention. Donc en retard.
Sans SDS, le composé D sort avec le flux EOF.
Composé E F :
Inversion par rapport à la charge apparente (1,05 pour E et 1,00 pour F)
!$&(,=>?E^_abr{|}~¼ëìóôõ P çàÙàÍÁÍÁͽàÙÁ½ààÁàwogbobob]½ h!;>* h!;5hh!;5h>Keh!;5h!;h!;5hB&ÍhWf5hB&ÍhWf>*hB&ÍhWf5>*OJQJ hB&ÍhúG
5>*CJ$OJQJ hB&ÍhWf5>*CJ$OJQJh!;hB&ÍhWf5OJQJhB&Íh(5OJQJ hB&Íh( hB&ÍhWf/jhB&Íh(5OJQJUmHnHtH u!#$%&'()*+,>?@ABCDE_`abrù÷ñìçìììììììåàììììììÞìììÜgd(gd!;$a$$@&a$
ÆÓo#rstuvwxyz{|~½ÛëõöQ R S ù ú û ü úúúúúúúúúúøððððëëëëðãããããã$a$gd!;gd!;$a$gd!;$a$P Q S Å ä ø
Ç
É
ì
b Æ æ è (
,
:
z
°
²
´
Þ
ô
ö
#$%lnoqrtµ¸¹»ÞáùôìåáÚáÚáÒáËôÃÚ¸ÚáÚáÚáÚáÚáÚáÚáÚáÚáÚ¯Úô¡¡áÚáÚÚáÚj`hôh!;UjThN
ÿh!;Uh!;5>*CJ aJ hE Rh!;5>*CJ aJ h!;mHnHuhnBÒh!;OJQJhnBÒh!;>* h9#ºh!;h!;CJEHüÿ hnBÒh!;h!; h¹3h!;h¹3h!;>* h!;>* hh!;2ü
*
/
óóóóIóóTkdh$$IfTP4Ö0°ÿw >Ç Ç öööÖÿÿÖÿÿ Öÿÿ Öÿÿ4Ö
Paöf4ytâ4¤TTkd$$IfTP4Ö0°ÿw >Ç Ç öööÖÿÿÖÿÿ Öÿÿ Öÿÿ4Ö
Paöf4ytâ4¤T $$Ifa$gdâ4¤/
0
;
@
A
P
U
ªITkd*$$IfTP4Ö0°ÿw >Ç Ç öööÖÿÿÖÿÿ Öÿÿ Öÿÿ4Ö
Paöf4ytâ4¤T $$Ifa$gdâ4¤TkdÐ$$IfTP4Ö0°ÿw >Ç Ç öööÖÿÿÖÿÿ Öÿÿ Öÿÿ4Ö
Paöf4ytâ4¤TU
V
`
e
f
r
w
ªITkdÞ$$IfTP4Ö0°ÿw >Ç Ç öööÖÿÿÖÿÿ Öÿÿ Öÿÿ4Ö
Paöf4ytâ4¤T $$Ifa$gdâ4¤Tkd$$IfTP4Ö0°ÿw >Ç Ç öööÖÿÿÖÿÿ Öÿÿ Öÿÿ4Ö
Paöf4ytâ4¤Tw
x
ªITkd$$IfTP4Ö0°ÿw >Ç Ç öööÖÿÿÖÿÿ Öÿÿ Öÿÿ4Ö
Paöf4ytâ4¤T $$Ifa$gdâ4¤Tkd8$$IfTP4Ö0°ÿw >Ç Ç öööÖÿÿÖÿÿ Öÿÿ Öÿÿ4Ö
Paöf4ytâ4¤T
Ç
È
É
ì
b Æ ò 6
|
ª¡$a$gd!; $@&a$gd!; $@&a$gd!;Tkdì$$IfTP4Ö0°ÿw >Ç Ç öööÖÿÿÖÿÿ Öÿÿ Öÿÿ4Ö
Paöf4ytâ4¤T !"#$%opqst¶·¸º»ßàáã:;÷÷÷÷÷÷ïê÷÷÷÷ï÷ïï÷ï÷÷ê÷ßïß $
& Fa$gd!;gd!;$a$gd!;$a$gd!;áâã;|
®±è@BikRS§¨¯°¸¹ÌÍÎÏÐèéüýþÿ%üõüõüíüõüõüõüõüåüåüõüõüõü×üËļ·¼¬Ä¬Ä¼¬Ä
z¬Ä¼¬ÄjÛohj(vh!;UjÉÆP
hj(vh!;UVjàlhj(vh!;UjIÆP
hj(vh!;UVjhj(vh!;U h!;>*hj(vh!;>* hj(vh!;hBvEh!;>*CJ aJ hj(vh!;5>*CJ aJ h9#ºh!;H*hrth!;H* hnBÒh!;h!;0ê맨¸Ðè)9QcúîãÛãîãúãîãÓÛÓÛÛÓÛÓÛÓÛÓÛ$a$gd!;$a$gd!; $
& Fa$gd!; $Ð^Ða$gd!; gd!;%&'()9:MNOPQcdwxyz{£¤¥¦§·¸ËÌÍÎÑÒÔñæÛÔÌÛÔ¾³ÛÔÌÛÔ¥ÛÔÌÛÔÛÔÌÛÔshÛÔd_ h!;5h!;j±|hj(vh!;UjãÈP
hj(vh!;UVj:zhj(vh!;Uj=ÉP
hj(vh!;UVj¤whj(vh!;Uj;ÈP
hj(vh!;UVj*uhj(vh!;UjåÇP
hj(vh!;UVhj(vh!;>* hj(vh!;jhj(vh!;Ujrhj(vh!;Uj_ÇP
hj(vh!;UV"c{§·ÏÐÑÕÖEFGZ^}¤ÀÁ '(X÷ë÷ã÷÷÷÷áÜáá×ááááááááÔáÔ@&$a$$a$$a$gd!; $
Æ a$gd!;$a$gd!;ÔÕµºÇÎ,3NW«²³µ·¾Z]^`}
¡¢ &'rs§¨ïðüþÿ ÷ðéðéðéðéðéðéðéðéðØðØðØðÍðÂð÷¸÷ðÍðÍðÍðÍð§§ðz$jhB&Íh×UmHnHtH u hB&ÍhH"±$jhB&ÍhH"±UmHnHtH u jhB&ÍhH"±UmHnHuhB&ÍhWf5>*hB&ÍhWfCJEHhB&ÍhWfCJEHüÿ jhB&ÍhúG
UmHnHu hB&ÍhIú hB&ÍhWfhB&ÍhWf5/XYmÌü
ýýýýýýýýýýýýýýýýýýýõõõõõõõõõ$a$gdH"± !"0FOQêý04ÔÕuÓãêñò*,^`hnvz¶¸ . / L M s t ùèùáÚÐÉÐÚÁ¹Ú¹Ú±Ú±Ú¥hquhÒ6ÐH* hÒ6ÐH*hfAhÒ6ÐH*hfAhÒ6Ð5hfAhÒ6Ð>*hB&ÍhÒ6Ð>*hÒ6ÐhB&ÍhÒ6Ð5hÙÐhÒ6ÐH*hÙÐhÒ6ÐH* hÒ6Ð5>*hB&ÍhÒ6Ð5>* hB&ÍhÒ6Ð hB&ÍhWf jhB&Íh×UmHnHu hB&Íh×2 !/0QRqr¨¸þ 56tÔÕ t÷÷÷÷ïïçççççççççççççççççççç$a$gdÒ6Ð$a$gdÒ6Ð$a$gdH"±tu¡¢äåtvèê02ú 0 V | ¤ Ä é ê ø ù * hÒ6Ð5>*hquhÒ6Ð5>*hquhÒ6ÐH*hÒ6Ð7 ¤ ¥ î ï P ® î C D b c p q £ × Ø Ù ð ñ & ' | } ÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷ìì÷÷÷÷÷÷÷÷ $
& Fa$gdÒ6Ð$a$gdÒ6Ð} á â !?!@!A!D!E!ª!«!¬!ý#þ#$$$$$$$$÷÷÷÷÷ïïïïïçââààÛÛÛÛÛÛÛÛÛÛ$a$$a$$a$gdH"±$a$gdp#ã$a$gdÒ6Ð$$ $
$ $ $
$$$$$$$$$$$$$$$$$±$²$Î$ú$
%%úúúúúúúúúúúúúúúúúúúúúúòúúúúú$a$gdBb×$a$ ¡$¢$©$ª$®$¯$±$Ð$Ñ$Ó$Ô$Ù$Ú$æ$ç$ò$ó$þ$ÿ$% %{%%
&&&&&& &¬&Ù&æ&' 'E'L'(4(5(8(9(H(I(J(N(O(Z([(\(](_(`(a(b(e(f(g(s(t(u(÷ó÷ó÷óìáìáìáìáìáìáìÚìÚìáìáìáìÓìÓìÓìÓìÊÀÊÀʹʹ¤Ê¹¤ÊhB&Íh45CJ \hB&Íh4CJ hB&Íh i 5CJ \ hB&Íh%jhB&Íh i CJ H*hB&Íh i CJ hB&ÍhÒlÆ hB&Íh ghB&ÍhWfCJEHüÿ hB&ÍhWfhBb×hBb×hBb×H*
